Summary
Aqui apresentamos um protocolo para a realização de restrição placa baseada em sólidos na dieta
Abstract
Redução da ingestão alimentar sem desnutrição ou fome é conhecido por aumentar a longevidade ea retardar o aparecimento de várias doenças relacionadas à idade em uma ampla gama de espécies, incluindo mamíferos. Ela também provoca uma diminuição no peso corporal e fertilidade, bem como níveis mais baixos de glicose plasmática, insulina e IGF-1 nesses animais. Este tratamento é muitas vezes referida como restrição dietética (DR) ou a restrição calórica (CR). O nemátodo Caenorhabditis elegans tem emergido como um organismo modelo importante para o estudo da biologia do envelhecimento. Manipulações ambientais e genéticos têm sido usados para modelar DR e têm mostrado que prolonga a vida em C. elegans. No entanto, muitos dos estudos relatados DR em C. elegans foram feitas por animais propagação em meios líquidos, enquanto a maioria dos estudos genéticos na área do envelhecimento foram feitos no ágar padrão sólido em placas de petri. Aqui apresentamos um protocolo DR usando o padrão sólido NGM placa de ágar-base com as bactérias mortas.
Protocol
1. Estabelecer uma curva de calibração para a estimativa das concentrações de bactérias
Esta seção descreve um método para a estimativa da concentração de bactérias por qualquer estirpe de bactérias dada (por exemplo, OP50, HT115) que será usado como fonte de alimento para os experimentos A restrição alimentar em C. elegans. Curvas de calibração em separado devem ser estabelecidos para cada bactéria cepa utilizada.
- Inocular uma única colônia de E. coli OP50 bactérias escolhidos de uma raia fresca de bactérias em agar LB em 3 mL de caldo LB líquido.
- Cultura local OP50 em 37 ° C shaker e permitir que as bactérias cresçam durante a noite.
- Prepare serial 2 diluições da suspensão bacteriana a partir da cultura durante a noite (2x, 4x, 8x, 16x, 32x).
- Medir a absorbância (densidade óptica) de cada diluição em 600 nm em espectrofotômetro em triplicado.
- Dilua cada suspensão bacteriana 1000000 vezes (1000 vezes diluição duas vezes).
- Spread 0,4 mL de suspensão bacteriana de cada diluição uniformemente sobre uma placa de agar 100 milímetros LB.
- Coloque placas de LB com OP50 em uma incubadora de 37 ° C por 18-24 horas.
- Contar o número de colônias de bactérias cultivadas em cada prato. A contagem de colônias são usados para calcular ufc (unidades formadoras de colônia) por ml para cada amostra.
- A relação entre a medida OD 600 valores e OP50 concentrações de bactérias pode ser estabelecida através da representação gráfica OD 600 como uma função da concentração de bactérias (UFC / mL) e realizando uma análise de regressão linear (Figura 1).
Soluções:
| Luria Broth (LB), 1L: | |
| 10 g | Bacto-triptona |
| 5 g | Extrato de levedura |
| 10 g | NaCl |
Adicione água deionizada para 1L.
Autoclave e armazenar em temperatura ambiente.
2. Preparação de sólidos placa baseada na dieta de restrição (SDR) placas
Esta seção descreve a preparação de placas para uso em chapas sólidas baseada em dieta de restrição (SDR) experimentos. Normalmente, considera-se uma concentração de bactérias de 1 x 10 11 ufc / mL como o ad libitum condição de alimentação e 1 x 10 8 ufc / mL como a condição ideal de alimentação DR para este método. No entanto, 4-6 diferentes concentrações de bactérias pode ser necessário para estabelecer uma relação dose-dependente completa para SDR e suas respostas.
- Inocular uma única colônia de E. OP50 coli bactéria em 3 mL de caldo LB líquido.
- Coloque a cultura OP50 em 37 ° C shaker e permitir que as bactérias cresçam por 6-8 horas.
- Transferir a cultura OP50 para um balão novo contendo 500 mL de caldo LB, e coloque a cultura OP50 de volta em 37 ° C shaker durante a noite.
- Medir o OD 600 da cultura OP50 para determinar a concentração de bactérias (a concentração é calculado utilizando a curva de calibração gerada em Part 1). Diluições apropriadas podem ser necessários para uma medição precisa da absorbância.
- Pellet OP50 bactérias por centrifugação a 1.500 g por 20 minutos.
- Ressuspender as bactérias a uma concentração de 1 x 10 12 ufc / mL.
- Preparar 10 mL cultura de bactérias em seis diferentes concentrações: 1 x 10 12, 10 11, 10 10, 10 9, 10 8, 10 7 ufc / mL.
- Pipetar 0,2 mL de cultura de bactérias para o centro de uma placa de 60 mm solidificou NGM. Evite tocar na superfície da placa com a ponta da pipeta, como nicks na superfície permitem worms para penetrar na placas de ágar.
- Placas lugar em 37 ° C incubadora por 1 hora.
- Aplicar 10μL de 100mg/ml carbenicilina e 10 mL de canamicina 50mg/ml a cada placa para prender o crescimento das bactérias.
- Placas de loja com diferentes concentrações de antibióticos de bactérias mortas a 4 ° C para uso futuro (até um mês). É importante preparar e armazenar placas suficiente para todo o experimento planejado pelo menos 1-2 dias adiante. Usando o mesmo lote de placas para todo o experimento é preferível.
- Para verificar a viabilidade das bactérias, raspar algumas bactérias para fora das placas DSE e espalhá-lo em uma placa NGM vazio com carbenicilina e canamicina. Coloque a placa em 37 ° C incubadora de 6-8 horas e em seguida, verificar para o crescimento das bactérias (sem o crescimento de bactérias deve ser observado).
Soluções
| Nematóide Crescimento Media (NGM), 1L: | |
| 3 g | NaCl |
| 2,5 g | Bacto-peptona |
| 20g | Agar |
| 1 mL | 1 M MgSO 4 |
| 1 mL | 1 M CaCl 2 |
| 1 mL | Colesterol 5 mg / mL |
| 25 mL | Fosfato de Potássio 1M, pH 6,0 |
Imediatamente despeje NGM líquido sobre 60 milímetros x 15 milímetros pratos petri em 10 alíquotas mL
3. Criação de experimentos SDR
Para a maioria dos estudos SDR-relacionados, tais como análise de tempo de vida e perfil de fertilidade, a preparação de uma era sincronizada população de vermes é essencial. Para outros estudos, simplesmente transferir worms de uma placa de OP50 regular para uma placa de SDR para iniciar a restrição alimentar. Nesta seção, um protocolo para criar uma análise de ciclo de vida para os animais SDR é descrito como um exemplo.
- Use um seletor de verme de platina para transferir 20-30 adultos reprodutivamente ativos em várias placas NGM regular com OP50. Dependendo do número de ovos necessários para os experimentos, mais adultos podem ser necessárias.
- Deixar as placas a 20 ° C por 4 horas para permitir a postura de ovos.
- Remove os adultos a partir da placa. As placas devem ser inspeccionados visualmente para os ovos.
- Deixar as placas a 20 ° C e permitir que a progênie de desenvolver na fase adulta Late-L4/day 1. Normalmente, isso leva de 3 dias para worms N2 selvagens tipos a 20 ° C.
- Transferência de um número adequado de adultos dia 1 na placa de SDR para iniciar a restrição alimentar.
- Para uma análise vida, criou um total de 6-8 com 10-20 placas worms por placa para cada condição SDR.
- Pontuação a viabilidade de cada minhoca a cada 2 dias até que todos os vermes já morreram. É fundamental que worms ser transferidos para placas DSE fresco todos os 12-48 horas para evitar a privação completa de alimentos.
4. Resultados representativos:
Mostrado na Figura 1 é um gráfico de uma curva de calibração representante para a estimativa das OP50 concentração em relação ao OD 600. A equação gerada pela análise de regressão liner pode ser usado para todos os cálculos futuro da OP50 concentrações de bactérias. Mostrado na Figura 2 é um exemplo de doseamento do efeito dos tratamentos SDR crônica na vida útil média de cepas de vírus diferentes. A linha azul representa uma resposta dose-dependente normal de tipo selvagem worms para SDR. A linha vermelha indica que o efeito tempo de vida de SDR é parcialmente suprimida pela DRR-2 oe, enquanto daf-16 (mu86) não tem efeito sobre SDR-induzida extensão vida. Método de detalhes para a realização de análise de ciclo de vida em C. elegans é descrita na literatura anterior 1-3.
Figura 1. Resultado Representante de uma curva de calibração para a estimativa de E. Concentração de Escherichia OP50. OP50 concentração é plotado como uma função da medida OD 600 valores. Barras de erro = SD cultura Overnight bacteriana foi diluída 8x 1.5x, 2x, 4x, 16x, 32x antes da medição de absorbância, e posteriormente diluído 1.000 x duas vezes antes da medição ufc.
Figura 2. Representante resultado de um C. elegans experimento vida comparando animais tipo selvagem N2 (azul) com dois mutantes diferentes (verde e vermelho) em resposta a SDR (Figura de Ching et al. 4). Barras de erro = SEM
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Discussion
Restrição dietética (DR) é conhecido por aumentar a longevidade ea retardar o aparecimento de várias doenças relacionadas à idade em uma ampla gama de espécies, incluindo mamíferos 5-7. Manipulações ambientais e genéticos têm sido usados para modelar DR em C. elegans, incluindo worms cultura em um meio semi-definido líquido 8,9, diluição da fonte de alimento de bactérias em meio líquido 10-12, e uso de mutantes comportamento que se alimentam em um ritmo mais lento 13. No entanto, imita genética de DR podem produzir fenótipos que não estão relacionados à RD, enquanto worms cultivo em meio líquido envolve as condições de crescimento que diferem das condições sólida placa de médio adaptado por laboratórios mais worm. Um protocolo DR realizada em placas sólidas padrão seria útil e, portanto, foi desenvolvida por vários grupos 4,14,15.
No protocolo aqui descrito, as bactérias são mortas por aplicação de dois antibióticos diferentes para as placas como forma de controlar o nível de ingestão de alimentos. Entretanto, os métodos alternativos, tais como exposição aos raios UV também pode ser usado para inibir o crescimento de bactérias.
Para evitar a privação completa de alimentos (fome, por exemplo) durante o curso de experimentos SDR, worms precisam ser transferidos para placas DSE fresco todos os 12-48 horas, conforme mencionado no passo 3.7. A freqüência da transferência depende da concentração de alimentos, número de vermes por placa, ea quantidade de descendentes produzidos pela cepa verme utilizada no experimento. Por exemplo, worms podem ser transferidos a cada 48 horas quando 20 CF512 estéreis [fer-15 (B26); fem-1 (hc17)] animais foram colocados em uma placas DSE contendo 1 x 10 7 ufc / mL OP50 bactérias. A freqüência da transferência deve ser determinada através da análise, antes do experimento, quanto tempo as placas DSE pode durar antes do semeado bacteriana é completamente consumido por vermes em condições experimentais. Ao realizar experimentos que duram várias semanas (por exemplo, análise ciclo de vida) com uma cepa não-estéril, 50μg/ml FUDR podem ser adicionados às placas DSE antes do passo 3.5 para eliminar postura. Caso contrário, worms terão que ser transferidos para placas fresco muito mais freqüência para evitar o esgotamento completo de alimentos devido à sua prole.
Enquanto não há limite no número de vermes que podem ser colocadas por placa em um experimento SDR, colocando mais de 20 animais por placa pode causar dificuldade em marcar uma análise de viabilidade de vida após o tratamento da SDR. É importante notar também que o SDR pode ser iniciada tão cedo quanto o dia 1 da vida adulta. No entanto, o início da SDR em fases iniciais de larva pode causar prisão de desenvolvimento em determinadas circunstâncias.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por um prêmio de piloto do Centro de Choque Nathan (P30 AG13283) e uma subvenção R01 (R01 AG028516) do Instituto Nacional do Envelhecimento (NIA) para A.-LH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbenicillin | Duchefa Biochemie | C0109.25 | Dissolved in water. |
| Kanamycin | Roche Group | 10106801001 | Dissolved in water. |
| Bacto-peptone | BD Biosciences | DF0118072 | |
| Bacto-tryptone | BD Biosciences | DF0123075 | |
| Bacto-yeast extract | BD Biosciences | DF0127071 | |
| Agar | BD Biosciences | DF00145170 | |
| Sterile culture tube | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| Spectrophotometer | Amersham | Gene Quant pro | Amersham is now part of GE Healthcare. |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Stemi 2000 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Accuspin FR |
References
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