Summary
我们证明在皮层神经元的应用荧光指标，TMRM TMRM荧光强度的相对变化，以确定应用程序之前和之后的一个特定的刺激。我们也应用荧光探针H
Abstract
线粒体膜电位（ΔΨm）是维持生理功能的呼吸链产生ATP的关键。的ΔΨm的一个重大损失，使细胞的能量耗尽，随后死亡。活性氧（ROS）是重要的信号分子，但他们在病理条件下的积累会导致氧化应激。在细胞内ROS的两个主要来源是环境中的毒素和氧化磷酸化的过程中。线粒体功能障碍和氧化应激有牵连的许多疾病的病理生理;因此，ΔΨm和ROS的能力，以确定可以提供有关的细胞和线粒体功能的生理状态的重要线索。
几个荧光探针（TMRM，罗丹明123，TMRE，JC - 1）可以用来确定在多种细胞类型Δψm，许多荧光指标（H 2 DCF - DA）可以用来确定活性氧，Dihydrorhodamine 123 Dihydroethidium 。几乎所有可用荧光探针用于评估ΔΨm或ROS是单一波长的指标，增加或减少其荧光强度成正比，增加或减少ΔΨm或ROS水平的刺激。因此，当务之急是在基准水平和应用特定的刺激后，这些探针的荧光强度来衡量。这允许一个确定的基线水平和刺激之间的荧光强度的变化的百分比。这种荧光强度的变化反映在ΔΨm或ROS相对水平的变化。在这段视频中，我们展示了如何应用在大鼠皮层神经元的荧光指标，TMRM，以确定在TMRM之间的基线水平和应用FCCP，线粒体解偶联剂后的荧光强度的百分比变化。 FCCP治疗造成下级TMRM荧光反映线粒体膜电位去极化。我们还展示了如何应用的荧光探针 H 2 DCF - DA的，以评估在皮层神经元的ROS水平，首先在基线和应用H 2 O 2后，然后。此协议（稍作修改），也可以用来确定在ΔΨm和ROS的变化，在不同类型的细胞和神经元在大脑的其他区域隔离。
Protocol
1。细胞培养
- 使用前面描述的技术和培养皿镀玻璃底部涂上聚- D -赖氨酸和层粘连蛋白1（MatTek公司，亚什兰，MA），孤立和皮层神经元生长。
2。准备的荧光探针TMRM和H 2 DCF - DA的股票解决方案
- 准备10毫米的TMRM原液5.0毫克的TMRM溶解在1 mL无水二甲基亚砜。涡它为1分钟。然后，分装和储存在-20 ° C，避光，并使用1个月内。
- 下一步，准备通过溶解在1毫升无水二甲基亚砜4.87毫克的H 2 DCF - DA的H 2 DCF - DA 10毫米的原液。同样，涡旋1分钟。然后，分装和储存在-20 ° C，避光，并使用一个星期内。
3。载入TMRM和H 2 DCF - DA大鼠皮层神经元
TMRM是一个电位，细胞渗透性的荧光指示剂，在线粒体内部高度带负电荷的的积累。重要的是要使用低浓度的TMRM（10-50纳米范围内），以避免自动淬火线粒体TMRM。然后，TMRM荧光信号可直接合作关系到整个内线粒体膜ΔΨm。一个原因TMRM泄漏造成损失的荧光强度的线粒体ΔΨm损失。 H 2 DCF - DA的是细胞渗透探头转换成DCF - DA的细胞内酯酶，其氧化荧光的DCF结果。终浓度的H 2 DCF - DA 2-10μM和它之间的范围应在来自不同脑区的神经元测试经验，因为高负荷的浓度可能会导致在DCF的荧光，即使在没有对H 2 O 2的饱和。任何内源性或外源性氧化剂（例如，一氧化氮，过氧化氢）的存在会增加DFC的荧光强度。下面，我们提供了一个用于装载TMRM和H 2 DCF - DA大鼠皮层神经元的协议。
- 要加载的与TMRM大鼠皮层神经元，洗的培养神经元的台氏缓冲（文字叠加3次：结核病：145 mM的氯化钠，5 mM的氯化钾，10 mM的葡萄糖，1.5毫米氯化钙 ，1 mM的氯化镁2，和10 mM的HEPES;用NaOH调整pH至7.4）。然后，准备1 / 1000倍稀释10毫米TMRM股票在结核病的20纳米的TMRM，然后添加2μL稀释TMRM每1毫升的结核病。与在室温避光45分钟TMRM孵育的神经元。 45分钟后，安装在显微镜的阶段的培养皿中，并开始成像。
- 负载与H 2 DCF - DA大鼠皮层神经元，洗培养的神经元有结核病的3倍。下一步，准备在结核病稀释H 2 DCF - DA的股票的1 / 10倍10毫米的H 2 DCF - DA 2微米，然后加入2μL 稀释 H 2 DCF - DA的每1毫升的结核病。然后，孵育45 min，室温在黑暗与H 2 DCF - DA神经元。 45分钟后，洗净的神经元与之前获得的图像，删除多余的荧光指示剂的结核病4倍。
4。实时成像TMRM培养的神经元，以确定ΔΨm
- 为了执行实时成像TMRM，共聚焦激光扫描显微镜（文字叠加：LSM 510，卡尔蔡司公司）孵育的神经元，与生活时间序列程序的应用程序，用于。适用于低分辨率和激光功率衰减（文本叠加：低解析度：256 × 256;激光功率：1％），以最大限度地减少获取图像，并避免漂白需要的时间。
- 。其次，调整TMRM加载使用反射光的神经元装的焦点。检查TMRM荧光照度在514纳米和570 nm处检测。设置一个摄像头略低于饱和度检测增益。
- 一旦所有参数，包括分辨率，激光电源，检测相机的增益，和间隔时间推移获得的图像设置，不改变这些设置之间的实验。接下来，更改字段。开始采集图像。
- 为了测试在ΔΨm的变化，如FCCP或2微克/毫升的寡，1微米的刺激可以被应用，这将大大去极化或超极化的线粒体膜电位，分别为。这些变化将反映在TMRM荧光强度，与基线荧光强度FCCP的情况下，或在TMRM寡的情况下的荧光强度的增加相比减少。
5。与H 2 DCF - DA的培养，以确定活性氧的神经元的实时成像
- 要与H 2 DCF - DA，首先培养的神经细胞进行实时成像，安装在显微镜的阶段培养皿中。调整我们细胞的焦点ING的反射光。检查DCF的荧光激发波长为488和515 nm处的排放。
- 其次，调整激光功率的5-7％，探测器增益，分辨率为256 × 256。不要更改这些设置之间的实验。然后，将获得使用时间系列节目的现场图像的频率。
- 选择一个新的领域，并开始获取图像。为了检测ROS水平的变化，治疗的H 2 O 2与100-200微米的细胞。这将体现在DCF的荧光强度的增加，与基线水平相比。
6。数据分析
- 使用感兴趣区域（文本叠加：投资回报率）从LSM程序的工具，选择的地区。然后，测量TMRM或ROS的荧光强度。选择从线粒体地区或整个细胞体成像的细胞来衡量TMRM或ROS的荧光强度，分别从投资回报率的投资回报。
- 从所有的每个细胞TMRM或全细胞ROS的所有细胞的每个时间点的成像机构的投资回报计算的平均荧光强度。选择地区旁细胞的背景荧光强度计算。采取多次测量和计算的平均背景强度。
- 从投资回报率，每次使用Microsoft Excel在每个单元的平均荧光强度减去平均背景荧光强度。减去背景强度后，正常化TMRM或DCF荧光强度，使用这个公式的基线荧光（文本叠加：ΔF= FF O / F O X 100，其中F =在任何时间点的荧光强度=基准荧光） 。然后，使用Sigma的剧情程序生成的波形图，显示随着时间的推移的荧光强度的变化。
7。代表性的成果
图1A显示了TMRM培养的大鼠皮层神经元的荧光图像。 FCCP此外，线粒体的解偶联剂，导致线粒体的去极化和亏损TMRM荧光强度（图1B）。此外FCCP（第350秒;图1C）前基线TMRM荧光水平保持稳定。随着时间的推移TMRM荧光变化的定量分析显示后FCCP（图1C）除了在TMRM荧光显着减少。
图1D显示与DCF装载的大鼠皮层神经元的的荧光图像。 H 2 O 2的结果除了增加在细胞体DCF的荧光强度（图1E）。基线DCF荧光水平不变（第120秒）前的H 2 O 2的应用程序。 DCF的荧光定时测量显示其稳定的水平，增加H 2 O 2处理（图1F）后。
图1。线粒体膜电位和生活大鼠皮层神经元的活性氧水平的评估。 （一）代表皮层神经元的荧光图像加载TMRM。扫描基线TMRM荧光后，神经细胞治疗与protonophore FCCP（1μM）。右边是一个伪与明亮的黄色和黑色代表最高和最低强度，分别TMRM荧光强度栏。从线粒体地区TMRM荧光损失表示的ΔΨm崩溃后FCCP治疗（B组）。 TMRM荧光强度的变化在不同时间点的定量表示FCCP治疗前后是显示面板C.（四）加载H2DCF - DA大鼠皮层神经元的荧光图像。确定基准DCF的荧光后，细胞治疗与200微米H 2 O 2，DCF荧光的变化进行了评估。在DCF荧光增加反映后，H 2 O 2处理（五）增加ROS水平。定量分析的DCF荧光的变化，前后H 2 O 2处理，显示面板F.比例尺= 10微米
Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi
活细胞成像的皮层神经元TMRM前后FCCP此外，使用40X目标。伪强度显示最大（FCCP除了前明亮的黄色）和下降（红色，后FCCP此外）TMRM后的荧光强度FCCP此外，点击这里查看视频
视频。 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi
H 2 O 2除了使用40X目标之前和之后，现场皮层神经元细胞DCF的成像。基线DCF的荧光在细胞体浅绿色和过氧化氢除了增加了DC明亮的绿色荧光强度F点击这里观看视频
Discussion
我们提出了一个一步一步的过程，描述如何确定在使用荧光灯指标TMRM 和 H 2 DCF - DA，分别的大鼠皮层神经元的ΔΨm和ROS。对于其他类型的细胞，是很重要的经验确定最终的TMRM或H 2 DCF - DA的浓度和加载时间。在一般情况下，TMRM浓度范围从20-200纳米，并与TMRM细胞孵育时间从20到60分钟不等。终浓度的H 2 DCF - DA的范围2-10μM，并装载包含这个指标的解决方案中的细胞孵育30-45分钟不等。
重要的是要优化激光功率和扫描速度的图像，同时避免光毒性细胞，并在没有任何刺激的情况下的荧光强度的变化（例如TMRM荧光闪烁）。优化的光学设置应在荧光信号，这不是在刺激的情况下，超过或低于饱和（阈值）的结果。取得的最佳条件，在选择一个特定的激光功率和扫描速度的领域收集的图像时，有探头的荧光强度在没有任何刺激10-15分钟的实时成像的情况下没有变化。
其他荧光探针来确定ΔΨm包括罗丹明123和四甲基若丹明乙酯（TMRE）。然而，他们发现，在孤立的线粒体 2抑制呼吸过程。更重要的是，TMRM没有线粒体呼吸的影响，并已在低浓度低的光毒性和漂白与其他探测器相比。 H 2 DCF - DA是一个很好的指标为活性氧的细胞，因为它是在保留和认识的几个氧化剂品种，如过氧化物，超氧化物，一氧化氮 4 。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院（K22NS050137 JCB卡）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| NbActive4 | BrainBits | NbActive4 | |
| TMRM | Invitrogen | T668 | |
| H2DCF-DA | Invitrogen | C400 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2∙2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| MgCl2∙6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630 |
References
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- Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys. J. 76, 469-477 (1999).
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- Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death. J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).
