Summary
Vi visar tillämpningen av den fluorescens indikator, TMRM, i kortikala neuron att fastställa den relativa förändringar i TMRM fluorescensintensitet före och efter tillämpningen av en särskild stimulans. Vi visar också tillämpningen av den fluorescens sonden H
Abstract
Mitokondriell membranpotential (ΔΨm) är avgörande för att upprätthålla fysiologisk funktion av andningskedjan att generera ATP. En betydande förlust av ΔΨm gör celler utarmat av energi med påföljande död. Reaktiva syreradikaler (ROS) är viktiga signalmolekyler, men deras ackumulering i sjukdomstillstånd leder till oxidativ stress. De två största källorna till ROS i celler är miljögifter och processen för oxidativ fosforylering. Mitokondriell dysfunktion och oxidativ stress har varit inblandade i patofysiologin för många sjukdomar, och därför kan möjligheten att bestämma ΔΨm och ROS ge viktiga ledtrådar om de fysiologiska status cellen och funktionen hos mitokondrierna.
Flera fluorescerande prober (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) kan användas för att bestämma Δψm i en mängd olika celltyper, och många fluorescens indikatorer (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA) kan användas för att bestämma ROS . Nästan alla av de tillgängliga fluorescens prober som används för att bedöma ΔΨm eller ROS är enda våglängd indikatorer, som ökar eller minskar deras fluorescensintensitet proportionell mot en stimulans som ökar eller minskar nivåerna av ΔΨm eller ros. Därför är det absolut nödvändigt att mäta fluorescens intensiteten av dessa sonder på ursprungliga nivå och efter tillämpningen av en specifik stimulus. Detta gör att man kan bestämma den procentuella förändringen i fluorescens intensitet mellan ursprungliga nivå och en stimulans. Denna förändring i fluoroscensintensitet speglar förändringen i relativa ΔΨm eller ros. I denna video visar vi hur du ansöker fluorescens indikatorn, TMRM i råtta kortikala neuron för att bestämma den procentuella förändringen i TMRM fluoroscensintensitet mellan ursprungliga nivå och efter användning FCCP, en mitokondriell uncoupler. De lägre nivåerna av TMRM fluorescens följd FCCP behandling återspeglar depolarisation av mitokondriell membranpotential. Vi visar också hur man ansöker fluorescens sonden H 2 DCF-DA för att bedöma graden av ROS i kortikala neuroner, först vid baseline och sedan efter tillämpning av H 2 O 2. Detta protokoll (med smärre ändringar) kan också användas för att fastställa förändringar i ΔΨm och ROS i olika celltyper och i nervceller isolerade från andra delar av hjärnan.
Protocol
1. Cellodling
- Kortikala neuroner är isolerade och odlas med hjälp av tidigare beskrivna tekniker och pläterade på kultur rätter med ett glas botten (Mattek Corporation, Ashland, MA) täckta med poly-D-lysin och laminin 1.
2. Förbereda stamlösningar för fluorescerande prober TMRM och H 2 DCF-DA
- Förbered en 10-mM stamlösning av TMRM genom att lösa 5,0 mg TMRM i 1 ml vattenfri dimetylsulfoxid. Vortex det i 1 min. Sedan gör alikvoter och förvara dem vid -20 ° C, skydda mot ljus och använd inom en månad.
- Därefter förbereda en 10-mM stamlösning av H 2 DCF-DA genom att lösa 4,87 mg H 2 DCF-DA i 1 ml vattenfri DMSO. Likaså virvel det i 1 min. Sedan gör alikvoter och förvara dem vid -20 ° C, skydda mot ljus och använd inom en vecka.
3. Laddar råtta kortikala neuron med TMRM och H 2 DCF-DA
TMRM är en potentiometrisk, cell-genomsläpplig fluorescerande indikator som ackumuleras i den mycket negativt laddade inre mitokondrier. Det är viktigt att använda låga koncentrationer (10-50 nm) av TMRM att undvika automatisk härdning av mitokondriell TMRM. Sedan kan fluorescensen signal TMRM vara direkt samarbete med anknytning till ΔΨm över det inre mitokondrie-membranet. En förlust av ΔΨm orsakar TMRM att läcka från mitokondrierna resulterar i en förlust av fluorescens intensitet. H 2 DCF-DA är cell-permeabla sond omvandlas till DCF-DA av intracellulära esteraser, och dess resultat oxidation i fluorescerande DCF. Den slutliga koncentrationen av H 2 DCF-DA varierar mellan 2-10 mikroM och det bör testas empiriskt i nervceller från olika områden i hjärnan eftersom hög belastning halter kan leda till mättnad av DCF fluorescens även i frånvaro av H 2 O 2. Förekomsten av endogent eller exogent oxidant (t.ex. kväveoxid, väteperoxid) kommer att öka DFC fluorescensintensitet. Nedan ger vi ett protokoll för lastning råtta kortikala neuron med TMRM och H 2 DCF-DA.
- För att ladda råtta kortikala neuron med TMRM första, tvätta odlade nervceller 3 gånger med Tyrode buffert (Text Overlay: TB: 145 mM NaCl, 5 mm KCl, 10 mm glukos, 1,5 mM CaCl 2, 1 mm MgCl 2 och 10 mM HEPES, justera pH till 7,4 med NaOH). Sedan förbereder 20 nm TMRM genom utspädning av 10 mM TMRM lager 1 / 1000 gånger i tuberkulos och tillsätt sedan 2 l utspädd TMRM per 1 ml av TB. Inkubera nervceller med TMRM i 45 minuter i mörker vid rumstemperatur. Efter 45 min, montera kulturen skålen på scenen av mikroskopet och börja avbildning.
- För att ladda råtta kortikala neuron med H 2 DCF-DA, tvätta odlade nervceller 3 gånger med TB. Nästa, förbereda 2 mikroM av H 2 DCF-DA genom att späda ut 10 mm H 2 DCF-DA lager 1 / 10 gånger i tuberkulos och tillsätt sedan 2 ìl av utspädd H 2 DCF-DA per 1 ml av TB. Sedan Inkubera nervceller med H 2 DCF-DA för 45 minuter i mörker vid rumstemperatur. Efter 45 minuter, tvätta nervceller 4 gånger med TB för att avlägsna överflödig fluorescerande indikator innan de har fått bilder.
4. Live avbildning av nervceller inkuberas med TMRM att avgöra ΔΨm
- Att spela live avbildning av nervceller inkuberas med TMRM, konfokala laserskanning mikroskopi (Text Overlay: LSM 510, Carl Zeiss Inc.), med tillämpning av levande tidsserier programmet används. Applicera med låg upplösning och försvagade lasereffekt (Text Overlay: låg upplösning: 256 x 256, laser effekt: 1%) för att minimera den tid som behövs för att få bilder och för att undvika fotoblekning.
- . Därefter justera fokus i den monterade nervceller laddad med TMRM med reflekterat ljus. Undersök TMRM fluorescens med belysning på 514 nm och vid 570 nm. Ställ upptäckt vinst på en kamera strax under mättnadsnivån.
- När alla parametrar som ingår upplösning, laser makt, upptäckt vinst på en kamera, och Time-lapse intervall för att få bilderna in, inte ändra dessa inställningar mellan experiment. Därefter ändrar fältet. Börja samla bilder.
- För att testa förändringar i ΔΨm kan stimuli som 1 mikrometer i FCCP eller 2 mikrogram / ml oligomycinkänslig, skall tillämpas, vilket avsevärt kommer att depolarize eller hyperpolarize den mitokondriella membranpotential, respektive. Dessa ändringar kommer att återspeglas genom en minskning av TMRM fluoroscensintensitet jämfört med baslinjen fluorescensintensiteten vid FCCP, eller en ökning av TMRM fluoroscensintensitet vid oligomycinkänslig.
5. Live avbildning av nervceller inkuberas med H 2 DCF-DA för att avgöra ROS
- Att spela live avbildning av nervceller inkuberas med H 2 DCF-DA, först montera kulturen skålen på scenen i ett mikroskop. Justera fokus på cellerna ossning reflekterade ljuset. Undersök DCF fluorescens genom excitation vid 488 nm och utsläpp på 515 nm.
- Därefter justera lasereffekten till 5-7%, detektor förstärkning, och upplösning på 256 x 256. Ändra inte dessa inställningar mellan experiment. Sedan ställa in frekvensen för att få live-bilder med hjälp av programmet tidsserier.
- Välj ett nytt fält och börja hämta bilder. Att påvisa förändringar i ROS nivåer, behandla celler med 100-200 mikroM av H 2 O 2. Detta kommer att återspeglas av en ökning av DCF fluorescensintensiteten jämfört med utgångsvärdet nivå.
6. Dataanalys
- Användning regionen av intresse (Text Overlay: ROI) verktyg från LSM program att välja områden. Sedan mäter TMRM eller ROS fluorescens intensiteter. Välj ROI från mitokondrie regioner eller ROI från hela cellen kroppen avbildas celler för att mäta fluorescens intensitet TMRM eller ROS, respektive.
- Beräkna den genomsnittliga fluorescens intensitet från alla ROI i varje cell för TMRM eller från helcells organ för samtliga avbildade celler för ROS för varje tidpunkt. Välj regioner bredvid cellerna att beräkna intensiteten bakgrundsfluorescens. Ta flera mätningar och beräkna den genomsnittliga bakgrunden intensitet.
- Subtrahera medelintensitet bakgrundsfluorescens från genomsnittet fluorescens intensitet ROI i varje cell för varje tidpunkt med hjälp av Microsoft Excel. Efter avdrag bakgrund intensitet, normalisera TMRM eller DCF fluoroscensintensitet till utgångsläget fluorescens med hjälp av denna formel (Text Overlay: ΔF = FF o / F o x 100, där F = fluorescensintensiteten som helst punkt, Fo = baslinje fluorescens). Använd sedan Sigma Plot programmet generera tomten som visar förändringar i fluorescensintensiteten över tiden.
7. Representativa resultat
Figur 1A visar en fluorescens bild av råtta kortikala neuron inkuberas med TMRM. Tillägg av FCCP, en mitokondriell uncoupler, leder till mitokondrie depolarisation och en förlust av TMRM fluorescensintensitet (Fig. 1B). Baslinjen TMRM fluorescens nivån är stabil före tillsats av FCCP (första 350 sek;. Fig 1c). Kvantitativ analys av TMRM fluorescens förändringar över tid visar en signifikant minskning i TMRM fluorescens efter tillsättning av FCCP (bild 1C).
Figur 1D visar fluorescens bilden av råtta kortikala neuron laddad med DCF. Tillsats av H 2 O 2 resulterar i ökad DCF fluorescensintensiteten i cell kroppar (Fig. 1E). Baslinjen DCF fluorescens nivå är oförändrad (de första 120 sek) före applicering av H 2 O 2. Time-lapse mätningar av DCF fluorescens visa sin stadiga nivåer, vilket ökar efter H 2 O 2 behandling (Figur 1F).
Figur 1. Bedömning av mitokondriell membranpotential och ROS halter i levande råtta kortikala neuroner. (A) representant fluorescens bild av kortikala neuron laddade med TMRM. Efter skanning baslinjen TMRM fluorescens var nervceller behandlades med protonophore FCCP (1 M). Till höger finns en pseudofärger intensitet bar TMRM fluorescens med lysande gula och svarta representerar högsta och lägsta intensitet, respektive. Förlusten av TMRM fluorescens från mitokondrie-regioner visar kollaps ΔΨm på FCCP behandling (panel B). Den kvantitativa representationen av förändringar i TMRM fluorescensintensiteten vid olika tidpunkter före och efter FCCP behandling visas i panelen C. (D) Fluorescens bilden av råtta kortikala neuron laddad med H2DCF-DA. Efter bestämning av baslinje DCF fluorescens var celler som behandlats med 200 mikroM H 2 O 2, och förändringen i DCF-fluorescens bedömdes. En ökning av DCF fluorescens återspeglar ökningen i ROS-nivåerna på H 2 O 2 behandling (E). Kvantitativ analys av förändring i DCF-fluorescens, före och efter H 2 O 2 behandling, visas i panelen F. Skala bar = 10 mikrometer
Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi
Levande cell imaging av TMRM i kortikala neuron före och efter FCCP dessutom med 40X objektiv. Den pseudofärger intensitet visar ett maximalt (ljusgul, innan FCCP tillägg) och minskad (rött, efter FCCP tillägg) TMRM fluorescensintensiteten efter FCCP tillsats. Klicka här för att visa video
Video. 7,5 - labmedia 2704_Joshi.avi
Levande cell imaging av DCF i kortikala neuron före och efter H 2 O 2 Dessutom med 40X objektiv. Baslinjen DCF fluorescens har ljusgrön färg i cell organ och H2O2 Dessutom ökar DCF fluorescensintensitet till ljusa gröna färgen. Klicka här för att visa video
Discussion
Vi har presenterat en steg-för-steg beskriver hur du avgör ΔΨm och ROS hos råtta kortikala neuron med hjälp av fluorescerande indikatorer TMRM och H 2 DCF-DA, respektive. För andra celltyper, är det viktigt att empiriskt fastställa det slutliga koncentration och lastning tid för TMRM eller H 2 DCF-DA. I allmänhet TMRM koncentrationer rad 20 till 200 nM, och cellen inkubationstiden med TMRM varierar från 20 till 60 min. Den slutliga koncentrationen av H 2 DCF-DA varierar från 2 till 10 mikroM, och inkubation av celler i en buffertlösning som innehåller denna indikator varierar från 30-45 min.
Det är viktigt att optimera laser makt och skanningshastighet att ta bilder för att undvika både foto-toxicitet för cellerna och förändringar i fluorescensintensitet (till exempel flimmer av TMRM fluorescens) i avsaknad av stimulans. Den optimerade optiska inställningar ska resultera i en fluorescens signal som inte är över i mättade eller (tröskel) i avsaknad av stimulans. Den optimala förutsättningar för att samla in bilder från ett valt fält vid en viss laser makt och en skanningshastighet uppnås när det inte finns några förändringar i fluorescensintensiteten av sonden i avsaknad av stimulans för 10-15 minuter av levande bilder.
Andra fluorescens sonder för att avgöra ΔΨm inkludera Rhodamine 123 och tetra metyl Rhodamine etylester (TMRE). Däremot fann man att hämma luftvägarna processer i isolerade mitokondrier 2. Viktigt har TMRM ingen effekt på mitokondriernas respiration vid låga koncentrationer 2 och har låg fototoxicitet och fotoblekning 3 jämfört med andra sonder. H 2 DCF-DA är en god indikator för ROS som den är väl kvar i cellerna och känner igen flera oxidant arter, såsom peroxider, super oxider och kväveoxid 4.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (K22NS050137 till JCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| NbActive4 | BrainBits | NbActive4 | |
| TMRM | Invitrogen | T668 | |
| H2DCF-DA | Invitrogen | C400 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2∙2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| MgCl2∙6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630 |
References
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J. Vis. Exp. , (2007).
- Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys. J. 76, 469-477 (1999).
- Ward, M. W. The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics. J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).
- Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death. J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).
