Summary
Biz belirli bir uyaran uygulamasından önce ve sonra, TMRM floresan yoğunluğu göreceli değişiklikleri belirlemek için kortikal nöronlarda, floresan gösterge, TMRM uygulama göstermektedir. Ayrıca floresan prob H uygulanmasını göstermek
Abstract
Mitokondrial membran potansiyeli (ΔΨm) ATP üretmek için solunum zinciri fizyolojik fonksiyonu korumak için kritik öneme sahiptir. ΔΨm önemli bir kaybı ölüme enerji tükenmiş hücreleri vermektedir. Reaktif oksijen türleri (ROS), önemli sinyal molekülleri, ancak patolojik durumların kendi birikimi oksidatif strese yol açar. Hücrelerde ROS iki önemli kaynakları, çevresel toksinler ve oksidatif fosforilasyon sürecinde. Mitokondriyal disfonksiyon ve oksidatif stres birçok hastalığın patofizyolojisinde suçlanmıştır, bu nedenle ΔΨm ve ROS belirleme yeteneği hücre ve mitokondri fonksiyonu fizyolojik durumu hakkında önemli ipuçları sağlayabilir.
Birkaç floresan probları (rodamin 123, TMRM, TMRE, JC-1) hücre tiplerinin çeşitli Δψm belirlemek için kullanılır ve çok sayıda floresan göstergeleri (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA) ROS belirlemek için kullanılabilir . Neredeyse tüm ΔΨm veya ROS değerlendirmek için kullanılan floresan probları ΔΨm veya ROS düzeylerini artırır veya azaltır bir uyarıcı ile orantılı olarak floresan yoğunluğu artırmak veya azaltmak tek dalga boyu göstergeleri. Bu nedenle, temel düzeyde ve belirli bir uyaran uygulamasından sonra bu problar floresan yoğunluğu ölçmek için zorunludur. Bu bir değişim, temel seviye ve bir uyarıcı arasında floresan yoğunluğu oranını belirlemek için izin verir. Bu değişiklik, floresan ΔΨm veya ROS göreli seviyeleri değişimi yansıtır. Bu video, biz, başlangıç düzeyi arasında ve FCCP, mitokondriyal uncoupler uyguladıktan sonra TMRM floresan yoğunluğu yüzde değişimi belirlemek için fare kortikal nöronların floresan gösterge, TMRM, nasıl uygulanacağını göstermektedir. TMRM floresan FCCP tedavi kaynaklanan düşük seviyelerde mitokondriyal membran potansiyelinin depolarizasyon yansıtmaktadır. Ayrıca floresan prob H 2 DCF-DA sonra H 2 O 2 uygulaması başlangıçta ilk kortikal nöronlarda ROS düzeyi, değerlendirmek ve nasıl uygulanacağını gösteriyor. Bu protokol aynı zamanda (küçük değişiklikler ile) farklı hücre tipleri ve diğer beyin bölgeleri izole nöronların ΔΨm ve ROS değişiklikleri belirlemek için kullanılabilir.
Protocol
1. Hücre kültürü
- Kortikal nöronların izole ve önceden açıklanan teknikler ve poli-D-lizin ve laminin 1 ile kaplanmış bir cam alt (Mattek Corporation, Ashland, MA) ile kültür kaplarına kaplama kullanılarak yetiştirilir.
2. Floresan probları TMRM ve H 2 DCF-DA için stok çözümler hazırlanması
- TMRM, 5.0 mg 1 ml susuz dimethylsülfoksit eriterek TMRM 10 mM stok solüsyonu hazırlayın. Vortex 1 dak. Sonra, alikotları yapmak ve -20 ° C'de saklayın, ışıktan korumak, ve bir ay içinde kullanın.
- Sonra, susuz DMSO 1 ml H 2 DCF-DA 4.87 mg eriterek H 2 DCF-DA 10 mM stok solüsyon hazırlanır. Benzer şekilde, vorteks 1 dak. Sonra, alikotları yapmak ve -20 ° C'de saklayın, ışıktan korumak, ve bir hafta içinde kullanabilirsiniz.
3. TMRM ve H 2 DCF-DA ile yükleme sıçan kortikal nöronların
TMRM mitokondri son derece negatif yüklü iç birikir potansiyometrik, hücre-geçirgen floresan gösterge. Mitokondriyal TMRM otomatik söndürme önlemek için TMRM düşük konsantrasyonlarda (10-50 nM aralık) kullanmak önemlidir. Sonra TMRM, floresan sinyal iç mitokondrial membran genelinde ΔΨm doğrudan işbirliği ile ilgili olabilir. ΔΨm kaybı floresan yoğunluğu kaybı ile sonuçlanan mitokondri sızması TMRM neden olur. H 2 DCF-DA hücre geçirgen prob, hücre içi esterazlar tarafından DCF-DA dönüştürülür ve floresan DCF oksidasyon sonuçları . Yüksek yükleme konsantrasyonları DCF floresan doygunluk H 2 O 2 yokluğunda bile neden olabilir DCF-DA, 2-10 mcM ve arasında değişmektedir H 2 farklı beyin bölgelerinden elde edilen nöronların nihai konsantrasyonu ampirik olarak test edilmelidir . Herhangi bir endojen veya eksojen oksidan varlığı (örneğin, nitrik oksit, hidrojen peroksit) DFC floresan yoğunluğu artacaktır. Aşağıda, TMRM ve H 2 DCF-DA ile sıçan kortikal nöronların yükleme için bir protokol sağlar.
- TB:: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukoz, 1.5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, ve 10 TMRM ile sıçan kortikal nöronların yüklemek için, ilk, Tyrode Kullanıcı tampon (Paylaşımlı Metin kültürlü nöronlar 3 kere yıkayın mM HEPES;) NaOH ile pH 7.4 'e ayarlayın. Ardından, TB 1 / 1000 kere 10 mM TMRM stok seyreltilmesiyle TMRM 20 nM hazırlamak ve daha sonra 2 TB başına 1 ml seyreltilmiş TMRM ul ekleyin. 45 dakika oda sıcaklığında karanlıkta TMRM nöronlar inkübe edin. 45 dakika sonra, mikroskop sahnede kültür çanak montaj ve görüntüleme başlayın.
- H 2 DCF-DA ile sıçan kortikal nöronların yüklemek için, TB kültür nöronlar 3 kez yıkayın. Sonra, TB 10 mM H 2 DCF-DA stok 1 / 10 kez seyreltilmesi ile H 2 DCF-DA 2 mcM hazırlamak ve daha sonra 2 TB başına seyreltilmiş 1 ml H 2 DCF-DA ul ekleyin. Daha sonra, oda sıcaklığında 45 dakika karanlıkta H 2 DCF-DA nöronlar kuluçkaya yatmaktadır. 45 dakika sonra, görüntüleri almadan önce aşırı floresan gösterge kaldırmak için TB nöronlar 4 kere yıkar.
4. ΔΨm belirlemek için TMRM ile inkübe nöron görüntüleme Canlı
- TMRM, konfokal lazer tarama mikroskobu (Metin Yerleşimi: EKK 510, Carl Zeiss A.Ş.) ile inkübe nöronların canlı görüntüleme gerçekleştirmek için, canlı zaman serisi programı uygulaması ile kullanılır. Görüntüleri elde etmek ve photobleaching önlemek için gerekli zamanı en aza indirmek için; düşük çözünürlüklü ve zayıflatılmış lazer gücü (düşük çözünürlüklü lazer gücü:% 1: 256 x 256 Metin Dağılımı) uygulayın.
- . Sonra, yansıyan ışık kullanılarak TMRM yüklü monte nöronların odağı ayarlayın. TMRM floresan aydınlatma ve 514 nm 570 nm dalga boyunda tespit inceleyin. Doygunluk seviyesinin altında sadece bir kamera tespit kazanç ayarlayın.
- Görüntüleri elde etmek için çözünürlük, lazer gücü, bir kamera tespit kazanç ve zaman atlamalı aralığını içeren tüm parametreleri sonra; deneyler arasındaki bu ayarları değişmez. Ardından, alan değiştirmek. Görüntü toplamaya başlayın.
- FCCP veya 2 mcg / oligomycin ml, 1 mcM gibi uyaranlara ΔΨm değişiklikleri sınamak için, önemli ölçüde sırasıyla, mitokondriyal membran potansiyeli depolarize veya hyperpolarize hangi uygulanan olabilir. Bu değişiklikler TMRM floresan FCCP durumunda bazal floresan veya oligomycin durumunda TMRM floresan yoğunluğunda bir artış ile karşılaştırıldığında bir düşüş yansıyacaktır.
5. ROS belirlemek için H 2 DCF-DA ile inkübe nöronlar Canlı görüntüleme
- Inkübe nöronlar H 2 DCF-DA, ilk canlı görüntüleme gerçekleştirmek için, bir mikroskop aşamasında kültür çanak monte edin. Hücrelerinin odağı ayarlayıning yansıyan ışık. 488 nm eksitasyon ve 515 nm dalga boyunda emisyon DCF floresan inceleyin.
- Sonra% 5-7, dedektör kazanç ve 256 x 256 çözünürlükte, lazer gücü ayarlayın. Deneyler arasındaki bu ayarları değiştirebilirsiniz etmeyin. Sonra, zaman serisi programını kullanarak canlı görüntüler elde etmek için frekansını ayarlayın.
- Yeni bir alan seçin ve görüntüleri almak başlayabilirsiniz. ROS düzeylerinde değişiklikler tespit için, 100-200 mcM H 2 O 2 hücre tedavisi. Bu başlangıç seviyesi ile karşılaştırıldığında DCF floresan yoğunluğunda bir artış ile yansıtılacaktır.
6. Veri analizi
- LSM program aracı: ilgi bölgesi (ROI Metin Dağılımı) alanlarını seçmek için kullanın. Sonra, TMRM veya ROS floresan yoğunlukları ölçmek. Mitokondriyal bölgelerde veya TMRM veya ROS floresan yoğunlukları sırasıyla ölçmek için görüntülü hücrelerinde tüm hücre gövdesi ROI'ler ROI'ler seçin.
- TMRM veya her zaman noktası için ROS için tüm görüntülü hücreleri için bütün hücre gövdeleri her hücrenin bütün ROI'ler ortalama floresan yoğunlukları hesaplayın. Eşiğe yoğunluğunu hesaplamak için hücrelerin yanında bölgeleri seçin. Çeşitli ölçümler ve ortalama arka planda yoğunluğunu hesaplamak.
- Microsoft Excel kullanarak her zaman noktası için her hücrede ROI'ler ortalama floresan yoğunlukları, ortalama bir arka plan floresan çıkarın. Arka plan yoğunluğu çıkarılarak sonra, bu formülü (: mesafe kadar taşınmış = FF o / F o x 100, F = bazal floresan için herhangi bir zaman noktasında = floresan yoğunluğu, Paylaşımlı Metin) kullanarak temel floresan TMRM veya DCF floresan yoğunluğu normale Sonra, zaman içinde floresan yoğunluğunda değişiklik gösteren arsa üretmek için Sigma Arsa programı kullanın.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1A TMRM ile inkübe fare kortikal nöronların bir floresan görüntüyü gösterir. FCCP eklenmesi, mitokondriyal uncoupler, mitokondriyal depolarizasyon ve TMRM floresan yoğunluğu (Şekil 1B) kaybına yol açar. Bazal TMRM floresan seviyesi FCCP ek önce (Şekil 1C ilk 350 sn) sabit kalır. Kantitatif analiz, zaman içinde TMRM floresan değişiklikler TMRM floresan FCCP (Şekil 1C) eklenmesinden sonra önemli bir azalma gösterir.
Şekil 1D DCF yüklü fare kortikal nöronların floresan görüntüyü gösterir. H 2 O 2 sonuç eklenmesi (Şekil 1E) hücre gövdeleri DCF floresan yoğunluğu arttı. Bazal DCF floresan seviyesi H 2 O 2 uygulama öncesi (ilk 120 sn) değişmez. Time-lapse DCF floresans ölçümleri istikrarlı düzeyleri gösterisi, H 2 O 2 tedavisi (Şekil 1F) sonra artış.
Şekil 1 mitokondriyal membran potansiyeli ve canlı sıçan kortikal nöronların ROS düzeylerinin değerlendirilmesi. (A) kortikal nöronların Temsilcisi floresan görüntü TMRM yüklendi. Temel TMRM floresan taradıktan sonra, nöronlar protonophore FCCP (1 mcM) ile tedavi edildi. Sağda, parlak sarı ve siyah temsil maksimum ve minimum yoğunluğu, sırasıyla TMRM floresan Pseudocolor yoğunluğu bar. Mitokondriyal bölgelerden TMRM floresan kaybı FCCP tedavi (panel B) üzerine ΔΨm çöküşünü gösterir. Farklı zaman noktalarında TMRM floresan yoğunluğu değişim kantitatif gösterimidir FCCP tedavi öncesi ve sonrasında H2DCF-DA yüklü sıçan kortikal nöronların Floresan görüntü paneli C. (D). Temel DCF floresan belirlendikten sonra, hücrelerin 200 mcM H 2 O 2 ile tedavi edildi ve DCF floresan değişimi değerlendirildi. DCF floresan bir artış H 2 O 2 tedavisi (E) üzerine ROS düzeylerinde artış yansıtır. DCF floresan değişimi nicel analizi, H 2 O 2 tedavi öncesi ve sonrası paneli F. Ölçek çubuğu = 10 mm gösterilir
Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi
FCCP Ayrıca 40X objektif kullanarak öncesi ve sonrası kortikal nöronlarda TMRM hücre görüntüleme yaşayın. Pseudocolor yoğunluğu maksimum (FCCP toplamadan önce parlak sarı) ve (kırmızı renk, FCCP eklenmesinden sonra) FCCP eklenmesinden sonra TMRM floresan yoğunluğu azalmış Videoyu izlemek için buraya tıklayın
Video. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi
40X objektif kullanılarak, H 2 O 2 ek öncesi ve sonrası kortikal nöronlarda DCF hücre görüntüleme yaşayın. DCF floresan bazal hücre gövdeleri, açık yeşil renkli ve H2O2 Ayrıca DC artırırF parlak yeşil renkli floresan videoyu görmek için buraya tıklayın
Discussion
Biz ΔΨm ve ROS floresan göstergeler sırasıyla TMRM ve H 2 DCF-DA kullanarak fare kortikal nöronlarda nasıl belirleneceğini anlatan bir adım-adım prosedürü sundu. Diğer hücre türleri için, ampirik TMRM veya H 2 DCF-DA için nihai konsantrasyonu ve yüklenme zamanını belirlemek çok önemlidir. Genel olarak, 20-200 nM TMRM konsantrasyonlarının aralığı ve TMRM hücre inkübasyon süresi 20 ila 60 dakika arasında değişir. H 2 final konsantrasyon DCF-DA 2-10 mcM aralıkları ve Bu gösterge içeren bir yükleme çözüm hücreler inkübasyon 30-45 dakika arasında değişir.
Herhangi bir uyaran yokluğunda hücreleri ve floresan yoğunluğu değişiklikleri (örneğin TMRM floresan titremeyi) hem fotoğraf toksisitesini önlemek için fotoğraf çekmek, lazer gücü ve yüksek tarama hızı optimize etmek için çok önemlidir. Optimize edilmiş optik ayarları uyaran yokluğunda (eşik) doymuş altında veya üstünde bir floresan sinyal sonuçlanması gerekiyor. 10-15 dakika canlı görüntüleme için herhangi bir uyarıcı olmaması halinde prob floresan yoğunluğu herhangi bir değişiklik olduğunda, belirli bir lazer güç ve tarama hızı Seçilen bir alandan görüntü toplamak için en uygun koşulları elde edilmektedir.
Diğer ΔΨm belirlemek için floresans problar rodamin 123 ve tetra metil rodamin etil ester (TMRE) içerir. Ancak, izole mitokondri 2 solunum proseslerini inhibe etmek bulundu. Önemlisi, TMRM düşük konsantrasyonlarda 2 mitokondriyal solunum üzerine etkisi yoktur ve düşük fototoksisite ve diğer problar ile karşılaştırıldığında 3 photobleaching vardır. H 2 DCF-DA hücrelerde muhafaza edilir ROS için iyi bir göstergedir ve bu peroksitler gibi bazı oksidan türlerin, süper oksitler ve nitrik oksit 4 tanır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (JCB K22NS050137) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C | |
| NbActive4 | BrainBits | NbActive4 | |
| TMRM | Invitrogen | T668 | |
| H2DCF-DA | Invitrogen | C400 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2∙2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| MgCl2∙6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630 |
References
- Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J. Vis. Exp. , (2007).
- Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys. J. 76, 469-477 (1999).
- Ward, M. W. The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics. J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).
- Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death. J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).
