Summary
Un protocolo para cortar las neuronas
Abstract
Las neuronas se comunican con otras células a través de los axones y las dendritas, las extensiones delgadas membranas que contienen las especialidades pre-o post-sináptica. Si una neurona se daña por una lesión o enfermedad, se pueden regenerar. Factores de las células intrínsecas y extrínsecas influyen en la capacidad de una neurona para regenerarse y recuperar la función. Recientemente, el nematodo C. elegans se ha convertido en un organismo modelo excelente para identificar los genes y las vías de señalización que influyen en la regeneración de las neuronas 1-6. La principal forma de iniciar la regeneración neuronal en el C. elegans es mediada por láser de corte, o axotomía. Durante axotomía, un proceso marcado con fluorescencia neuronal se corta con pulsos de alta energía. Inicialmente, la regeneración neuronal en el C. elegans fue examinada usando un láser de femtosegundos amplificados 5. Sin embargo, estudios posteriores han demostrado que la regeneración de un láser pulsado convencional puede ser utilizado para cortar con precisión las neuronas in vivo y obtener una respuesta similar de regeneración 1,3,7.
Se presenta un protocolo para llevar a cabo in vivo con láser axotomía en el gusano utiliza un láser pulsado MicroPoint, un sistema de llave en mano que está fácilmente disponible y que se ha utilizado ampliamente para la ablación de células específicas. Se describe la alineación del láser, el montaje de los gusanos, el corte neuronas específicas, y la evaluación de la regeneración posterior. El sistema ofrece la posibilidad de cortar un gran número de neuronas de gusanos múltiples durante un experimento. Por lo tanto, el láser axotomía como se describe aquí es un sistema eficiente para la iniciación y el análisis del proceso de regeneración.
Protocol
1. Montaje del sistema
Los componentes específicos de nuestro sistema se describen a continuación. Cuando está bien ensamblado, el usuario debe ser capaz de enfocar el microscopio con una mano, mueve el escenario con el otro (ya sea con el ratón o el joystick), activar el láser con el pedal de pie, y tener una visión clara de la en- imagen de la pantalla.
- MicroPoint láser montado en el puerto de epi-fluorescencia de un microscopio compuesto. Utilizamos un 80i Nikon, pero cualquier ámbito de investigación de calidad en posición vertical o invertida debería funcionar. El sistema MicroPoint incluirá una dicroica personalizada, que debe coincidir con el fluoróforo que las etiquetas de las celdas que desea cortar. Células de corte marcado con fluoróforos alternativa requiere dicroicos adicionales. Además, un generador de impulsos y el pedal vienen con el sistema MicroPoint.
- 100x, 1,4 NA objetivo de aceite para la realización de la cirugía y la evaluación de la regeneración, además de los objetivos adicionales que sean necesarios para la localización de la muestra en la diapositiva. Utilizamos una Nikon Plan Apo VC para la cirugía, y encontrar que un 4x es útil para el enfoque grueso y la búsqueda de la muestra.
- Motorizados escenario con joystick. Un escenario con una precisión extremadamente alta y la repetibilidad es innecesaria, ya que el escenario sólo se utiliza para la orientación. Nosotros usamos un Prior II OptiScan (véase la discusión).
- Cámara. La cámara tiene que proporcionar una velocidad suficiente para el enfoque y objetivo de la neurita etiquetados con el objetivo de 100x, mientras se visualiza la imagen en el monitor de la computadora. Preferimos atenuar la luz de la iluminación durante el procedimiento de axotomía para evitar posibles efectos de confusión de la foto-decoloración o daño (ver 1.7, abajo). De este modo, la cámara tiene que ser lo suficientemente sensible como para dar cabida a este nivel de reducción de la luz. Utilizamos un Hamamatsu Orca 05G, y encontrar que las imágenes de 16,3 Hz es suficiente. Cámaras equivalente podría ser sustituido.
- Computadora, el monitor y las imágenes de software que puede manejar la cámara. Además, se utiliza el software de imágenes para manipular la platina con el ratón (ver discusión).
- Aire mesa. Este requisito puede variar dependiendo de la ubicación, pero ya que la cirugía se realiza con un objetivo de 100x, nos encontramos con el aislamiento de vibraciones que son esenciales.
- Suministro de luz con guía de luz y el mecanismo del obturador para iluminar el fluoróforo. La guía de luz se adhieren a la MicroPoint. El mecanismo del obturador es útil para reducir la intensidad de la iluminación de forma independiente del láser. Nosotros usamos un Prior Lumen 200 o una Leica EL6000, y atenuar hasta un 80% de intensidad de luz total para axotomía.
2. Láser de configuración
Un protocolo detallado para alinear inicialmente y el enfoque del láser se suministra con el sistema láser MicroPoint. Suponemos que el procedimiento se ha seguido con éxito en la configuración inicial. Esto incluye la alineación del láser con el punto de mira en el ocular. Aquí les ofrecemos un protocolo para el mantenimiento regular de enfoque del láser y la intensidad.
Como se indica en el manual de MicroPoint, el láser pulsado de nitrógeno es capaz de dañar gravemente el ojo humano. Se debe tener cuidado a no mirar directamente al rayo láser. Una vez instalado, el filtro de barrera de seguridad debe bloquear la radiación a través de los oculares.
Corte de las neuronas de un organismo del tamaño de un grano de arena puede ser un reto. Desde el área de los daños causados por el láser es muy pequeña, es esencial conocer la ubicación tridimensional de enfoque del láser para apuntar a la muestra con precisión. El enfoque de láser se encuentra con la diapositiva espejo. En primer lugar, comprobar que la localización del foco z láser coincide con el enfoque de la ruta de la imagen. A continuación, la posición xy del enfoque de daños está marcado con punto de mira en el software de imágenes.
Centrándose en el plano z
- Presione el filtro de densidad neutra ND16 (Figura 1a). Usamos filtros de densidad neutra en el camino de epi-iluminación para atenuar el láser durante el enfoque. Para centrarse aún más fina, empuje, tanto en el ND16 y ND4 filtros fluorescentes.
- Ajuste el láser MicroPoint a un pulso con el interruptor de vuelta a 'Select' (Figura 1b), y luego mover la rueda de filtros a la correspondiente filtro de barrera largo de paso (Figura 1c).
- Colocar la placa de espejo en el escenario y se centran en pequeños agujeros en ella con el objetivo de 4x con luz transmitida.
- Añadir una gota de aceite de inmersión a la diapositiva espejo y volver a centrarse en agujeros con el objetivo de 100X. Abrir el obturador de la cámara con la ruta de la palanca de conmutación óptica (Figura 1d) y el disparador láser (Figura 1e). Si es necesario, reducir la intensidad de luz transmitida para que los bordes de los orificios son claras: esto ayuda a centrar con exactitud.
- Presione el pedal. Esto debería producir un pequeño agujero en el espejo si el láser se enfoca correctamente.
- Enfocar el microscopio ligeramente por encima del plano de la corredera de espejo y disparar el láser de nuevo. Esto debería hacer una aún más pequeñaagujero que el primer tiro, o no dejan marca en absoluto. Repita centrándose debajo de la diapositiva espejo.
- Si un agujero no se produce en 2.5, o si un agujero más grande se produce cuando se enfoca por encima o por debajo de la superficie del espejo, reenfocar el láser con el anillo de enfoque en la cabeza la ablación. Verificar que el agujero sigue siendo alineada con el punto de mira en el ocular. Con el uso constante, el enfoque plano z rara vez necesita ser ajustado.
Centrándose en el plano xy
- Siga los pasos del 2.1 al 2.3 anterior y presione el pedal para hacer un pequeño agujero en la diapositiva espejo.
- Iniciar 'en vivo' el modo de captura de "tomar prestado" los elementos del menú. En la 'medida' barra de herramientas, seleccione 'ROI editor, a continuación, seleccione la herramienta de "traición" y arrastre el punto de mira para alinearlos con el centro del agujero de nuevo. Haga clic en "Guardar retorno de la inversión", "Salir del editor" y luego y reanudar el modo de captura en vivo.
- Activar el "ratón XY" en la configuración Elementos de manipular el escenario con el ratón.
- Saque el filtro de densidad neutra (s) a la posición original (s), conjunto de los pulsos de láser a 10, y eliminar la diapositiva espejo.
Ajuste de la potencia del láser
- La potencia del láser se debe ajustar a la potencia mínima necesaria para reducir la neurona de su elección. Ajustar la potencia al mover la placa atenuador (Figura 1 F) durante el corte gusanos vivos (descrito más adelante). Si la potencia del láser es muy alto, va a causar un daño periférico o explosión de un agujero en el gusano. Si la potencia del láser es muy baja, no va a romper la neurona. Una vez que el sistema ha sido establecido, la posición del atenuador rara vez necesita ser cambiado. Si el láser se debilita, y la placa atenuador debe moverse para continuar el corte, que podría ser una señal de que el medio de contraste en la celda de medio de contraste debe ser reemplazada (ver discusión).
3. Inmovilizar a los gusanos
- Prepare una solución de 3% agarosa fundida en M9 (KH2PO4 22mm, 42mm Na2HPO4, 85 mm de NaCl, 1 mM MgSO4). Dispense 5 ml de agarosa fundida en un tubo Falcon de 15 ml. Llenar otro tubo con agua. Colocar los tubos en un elemento de calefacción modular ajustado a 55 ° C. Rellene el elemento de calefacción con agua para crear baños de agua pequeño para cada tubo. Nota: agarosa se puede preparar en grandes cantidades por adelantado y refundido para experimentos posteriores.
- Coloque dos capas de cinta de etiquetado en cada uno de los dos toboganes y una lámina limpia entre las diapositivas. Prescindir de una gota de agarosa usando una pipeta bombilla de plástico a la mitad de la lámina limpia y colocar otra perpendicular a la primera diapositiva de modo que el resultado de agarosa almohadilla es el espesor de dos pedazos de cinta (Figura 2). Eliminar una de las dos diapositivas de la almohadilla después de 30 segundos. Enjuague y almacenar la pipeta de plástico en el tubo lleno de agua halcón para su uso con las siguientes diapositivas.
- Lugar el próximo, 3.5 L de 0,10 m o 0,05 m perlas de poliestireno en el centro de la almohadilla. Añadir gusanos 5.10 que expresa la proteína fluorescente en las neuronas de interés. Si las neuronas de interés son de distribución asimétrica en el lado derecho o izquierdo del gusano, utiliza una selección de platino para voltear los gusanos para que el lado correcto hacia arriba. Los gusanos se debe colocar en las diapositivas de 10 minutos de la preparación de las pastillas de agarosa.
- Con cuidado, coloque una hoja de cubierta de los gusanos. Después de colocar la hoja de la cubierta, no se mueven lo relativo a la plataforma de agarosa ya que esto alterar la cutícula y destruir a los gusanos. Coloque el portaobjetos preparado en la platina del microscopio.
4. Cortar las neuronas
- La luz directa por los oculares con la palanca de conmutación óptica camino. Se centran en que el gusano se puede cortar con el objetivo de 4X, coloque una gota de aceite en la hoja de la cubierta, y el interruptor con el objetivo de 100X. Volver al camino óptico de la cámara.
- Usa el ratón para mover la neurona de su elección en el centro de la cruz. Presione el pedal para disparar el láser y romper el proceso neuronal. Si es necesario, dos conjuntos de impulsos se pueden utilizar para cortar la neurona. Al principio, es útil para rastrear con precisión que las neuronas se han roto en los gusanos individuales con el fin de evaluar la regeneración posterior. Cuando se realiza correctamente, el láser axotomía produce una pequeña pausa en la neurona sin causar daños importantes en el tejido de la piel circundante o de otras neuronas (ver figura 3). En ciertos casos, una pequeña cicatriz puede formar alrededor de la zona de la lesión.
- Recuperar los gusanos mediante la eliminación de la hoja de la cubierta en un movimiento ascendente directo, teniendo cuidado de que los gusanos permanecen en la plataforma de agarosa. No deslice el cubreobjetos off. A continuación, cortar la almohadilla alrededor de los gusanos con unas pinzas de punta fina y el lugar de la sección de agarosa en un plato recién sembrado NGM contiene OP50 8. Lugar 10 l de agua estéril M9 en la plataforma para liberar a los gusanos de las cuentas y eliminar de agarosa.
5. Puntuación para la regeneración de las neuronas
- Preparar agarosa al pad como se indica en el paso 2.2.
- Gusanos lugar en 3.5 ymu, L de perlas de poliestireno. Tapar con un cubreobjetos. Las diapositivas se pueden preparar de forma secuencial, o bien todos los gusanos se pueden preparar con antelación y las diapositivas de mantenerse en platos de 10 cm la cultura, cada uno con un Kimwipe húmedo para mantener la humedad de agarosa.
- Utilice el objetivo 100X para visualizar las neuronas cortadas. En muchas neuronas, un tronco neuronal distal a la zona de corte se mantendrá. Usamos la presencia de este remanente como un indicio de que la neurona se cortó de hecho (Figura 4). La presencia de esta cepa permite distinguir una neurona que se ha cortado y se regenera a partir de uno que no se corte. Nota: tanto los tocones distal y proximal inicialmente retractarse después de ser cortado.
- Evaluar la regeneración. Una variedad de parámetros se puede determinar. Un simple ensayo es determinar si la neurona lesionada se ha formado un cono de crecimiento (Figura 4) y se regenera, o no (Figura 4b). Por otra parte, la longitud de las neuritas se puede rastrear y comparar.
6. Los resultados representativos
A modo de ejemplo, se describe la caracterización de la regeneración del ácido γ-aminobutírico (GABA), las neuronas motoras. Estas neuronas, que residen en el cordón nervioso ventral y ampliar los procesos de forma circunferencial para el cordón nervioso dorsal, son esenciales para la locomoción adecuado 9. Las neuronas GABA pueden ser visualizadas por expresar un fluoróforo genéticamente codificados, como la proteína verde fluorescente (GFP), bajo el control de la UNC o -47 -25 unc promotores (cepas EG1285 y CZ1200, respectivamente, disponibles en el C. elegans Centro Genético ).
Monte L4-etapa gusanos como se describe, dar la vuelta a los gusanos que las neuronas GABA sobre su costado derecho son hacia arriba, y colocar el cubreobjetos. Cortar 1-3 de las comisuras posterior de cada gusano, a medio camino entre los cordones dorsal y ventral. Evite cortar las comisuras que se cruzan o fasciculados con comisuras otros, ya que son difíciles de calificar más adelante. Recuperar los gusanos como se describe.
18 a 24 horas después de axotomía éxito, los gusanos se han recuperado de la cirugía y la exhibición de locomoción normal y la puesta de huevos comportamientos. Deseche los gusanos que han muerto o están enfermos. Vuelva a colocar el resto tal como se describe, y evaluar la regeneración. Por lo general, tienen por objeto evaluar al menos 30 neuronas corte por condición experimental. En oxIs12 animales, por lo general el 60-70% de las neuronas GABA cortada L4 se han puesto en marcha una estructura de cono de crecimiento, evidenciado por la ampliación de la membrana en la punta y la extensión de las neuritas varias ramas, y emigró desde el sitio de corte (Figura 4). En muchos casos, los conos de crecimiento se han migrado a reconectarse con el cordón nervioso dorsal, una comisura neuronal adyacente, o el muñón distal. El restante 30% de las neuronas se han iniciado o no el crecimiento, la formación de un muñón proximal al sitio de axotomía, o se han extendido sólo pequeñas filopodios (Figura 4b).
Figura 1. La UV láser pulsado sistema axotomía. Los componentes específicos son: (a) los filtros ND (b) Impulso de selección (c) la palanca de la rueda de filtros (d) La ruta de conmutación óptica palanca (e) disparo láser y (f) Una placa atenuador.
Figura 2. La preparación de una plataforma de agarosa. Para preparar una plataforma de agarosa del grosor deseado, dos capas de cinta (verde) se colocan en dos diapositivas. Una diapositiva se coloca entre los dos primeros, y una gota de agarosa se añade a la lámina limpia. Por último, una cuarta diapositiva se coloca perpendicular a los tres primeros, lo que resulta en una plataforma que es el espesor de dos pedazos de cinta.
Figura 3. Representante de las neuronas GABA axotomies. En un experimento típico, GABA comisuras neurona se cortan a la mitad de la cara lateral del gusano. Una comisura cortada se muestra inmediatamente antes (izquierda) y después (derecha) axotomía. Todas las imágenes fueron tomadas con un objetivo de aceite de 100X.
Figura 4. Los resultados representativos de GABA axotomies neurona. 24 horas después de axotomía axones dañados se anotó para la regeneración. Un axón con la regeneración de un cono de crecimiento (flecha) se muestra en (a) mientras que una regeneración axonal no es visto como un muñón proximal (flecha) en (b). El muñón distal del axón de cada corte se muestra en cada panel (cabeza de flecha) y es una indicación de que el axón se ha roto.
Discussion
Una variedad de sistemas de láser se han utilizado para cortar las neuritas en C. elegans, y varios estudios han examinado en detalle su funcionamiento 3,7,10,11. El láser MicroPoint utilizados en nuestro protocolo es un sistema llave en mano que es fácil de configurar y mantener, y está disponible a un bajo costo a los investigadores en comparación con un sistema de Ti-Zafiro láser. En comparación con un sistema de Ti-Zafiro, sin embargo, el láser MicroPoint se espera que cause daño a un área más grande, que puede ser perjudicial para algunas aplicaciones. Si un sistema de Ti-Zafiro es deseada, un protocolo de excelente en la construcción de un sistema está disponible 12.
El protocolo actual se puede realizar en una variedad de neuronas en C. elegans, sin embargo, observamos que las diferencias en la capacidad de regeneración entre los distintos tipos de neuronas se espera 13. Además, diferentes orígenes transgénicos pueden afectar el éxito de regeneración. Aunque el porcentaje de regeneración de las neuronas GABA es bastante consistente entre las diferentes cepas transgénicas marcador, hemos observado un aumento global leve en la regeneración de juIs76 14 vs 15 oxIs12 gusanos. Las diferencias entre los marcadores de las neuronas de contacto también se han descrito 2.
Nosotros preferimos para inmovilizar a los gusanos con microesferas en lugar de anestésicos como las cuentas de resultado más rápido y la inmovilización más consistente 16. Esto también es ventajosa, ya que son capaces de observar la regeneración libre de cualquier posible efecto de confusión debido a la anestesia 17. Una alternativa anestésica sin método de inmovilización es el uso de dispositivos de microfluídica. El uso de microfluidos para axotomía se ha descrito ampliamente 17-22.
Nos encontramos con que con el uso constante, las funciones de láser mejor cuando la cumarina 440 en la celda de medio de contraste se cambia una vez por semana siguiendo el procedimiento descrito en el manual de MicroPoint. Si es necesario, el control deslizante de atenuación se puede utilizar para aumentar la potencia, pero esto puede ser un indicio de un colorante de edad o falta de alineación láser. Además, la celda tiene un tinte de vida útil limitada y eventualmente tendrá que ser reconstruido o reemplazado (Consulte Solución de problemas).
Puede ser difícil de maniobrar la neurita objetivo en la mira de que marca el centro de láser, sobre todo si el animal está completamente paralizado. Nos encontramos con que una etapa de manual no es óptima para este propósito, aunque es ciertamente útil. Una etapa de mando con control motorizado es más preciso, y nos encontramos con que el uso de software que soporta la imagen arrastrando con el ratón para mover la platina es el mejor. Elementos de Nikon ofrece esta característica y se describe en este protocolo, pero el paquete micromanager libre, así como software de imagen, pueden tener una funcionalidad similar. Una forma diferente de la orientación fina para mover el foco de láser, en lugar del animal. Un galvanómetro orientación del haz mecanismo está disponible como un add-on para el láser MicroPoint, si este enfoque es el preferido.
Además de su aplicación al estudio de la regeneración neuronal, el láser puede ser usado para la ablación de otros tipos de células, como piel, músculos o células especializadas, o para alterar las sinapsis neuronales específicos 23-27. Por otra parte, las vías que regulan la degeneración de las neuronas que acompaña a una lesión o enfermedad puede ser investigado con este sistema. Como tal, el uso de láseres pulsados continuará para arrojar luz sobre dos de los factores genéticos y los cambios biológicos celular que facilitan la regeneración neuronal y otros procesos pertinentes.
Solución de problemas:
Aquí descritos son algunos de los problemas comunes y sus soluciones asociadas.
- El láser no es cortar correctamente. Esto es probable, ya sea porque el láser está fuera de foco (ver sección 2), o el tinte en la celda de medio de contraste debe ser repuesta (ver MicroPoint manual). Por otra parte, la célula de tinte deben ser reemplazados o reconstruidos.
- Los gusanos se están moviendo en la plataforma de agarosa. Esto es generalmente un signo de que la plataforma de agarosa es demasiado húmedo. Nos encontramos con que las almohadillas deben dejarse durante aproximadamente 30 segundos antes de que los gusanos se colocan sobre ellos para evitar este problema. También puede intentar usar el menor tamaño (0,05 m) microesferas.
- La recuperación de los gusanos es difícil e ineficiente. Esto puede ser causado por la eliminación cubreobjetos incorrecta o por una almohadilla seca de agarosa. Si la superficie es muy seca, usted puede notar que los axones desarrollar una apariencia de cuentas. En algunos casos, esto se debe a que los gusanos no se colocaron en la plataforma lo suficientemente rápido después que se hizo. Por otra parte, una madre vieja de la solución de agarosa puede tener una concentración superior al 3% después de la fusión repetida.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Trabajar en el laboratorio Hammarlund está financiado por: NIH R01-01 y NS066082 T32GM007223, la Fundación Beckman y la Ellison Medical Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05 μm Polystyrene Beads | Polysciences, Inc. | 08691 | |
| 0.10 μm Polystyrene Beads | Polysciences, Inc. | 00876 | |
| Agarose GPG/LE | American Bioanalytical | 00972 | Ultra pure |
| Falcon 14 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352057 | 17 x 100 mm style, nonpyrogenic |
| Thermo Scientific Plain precleaned microscope slides | Erie Scientific | 420-004T | 3" x 1" x 1 mm |
| Cover Slips | VWR international | 48366 205 | 18 mm x 18 mm No. 1 1/2 |
| KIMTECH Science Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| BD Falcon 100 x 15mm Style Petri Dish | BD Biosciences | 351029 | |
| Tape blank 3/4w x 500L | TimeMed | T-512 | |
| Immersion oil | Nikon Instruments | Type A, nd=1.515 | |
| EG1285 or CZ1200 | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ | |
| OptiScan II | Prior Scientific | ||
| NIS-Elements Ar or Br | Nikon Instruments | ||
| MicroPoint Ablation Laser System | Photonic Scientific | ||
| Compound microscope | Nikon Instruments | Eclipse 80i | |
| Hamamatsu Camera | Hamamatsu Corp. | Model C8484-05G01 | |
| Dell Precision T3400 PC with Intel Core 2 Duo | Dell | ||
| Windows XP Professional | Microsoft | Version 2002, Series Pack 3 | |
| Dual dry bath Incubator | Fisher Scientific | Analog controls | |
| 4X Plan Fluor objective | Nikon Instruments | ||
| 100X Plan Apo VC oil objective | Nikon Instruments | ||
| Dumont #5/45 forceps | Dumont | 11251-35 | Dumoxel standard tips, can also use #7 |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | With NI-150 High Intensity Illuminator |
References
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