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Neuroscience

C 在体内激光干切断线虫

Published: May 19, 2011 doi: 10.3791/2707
* These authors contributed equally

Summary

减少神经元的协议

Abstract

神经元与其他细胞通过轴突和树突,修长的膜扩展,包含前或突触后专业沟通。如果一个神经元受到伤害或疾病受损,可能会再生。细胞内在和外在因素的影响,神经元的再生能力和恢复功能。近日,线虫C.线虫已经成为一个很好的模式生物基因识别和信号转导通路,影响神经元1-6的再生。启动C.神经再生的主要途径线虫是介导的激光切割,或干切断。干切断期间,一个荧光标记的神经元过程中使用高能量的脉冲被切断。起初, C中的神经再生线虫是研究用放大飞秒激光5。然而,随后的再生的研究表明,传统的脉冲激光可以用于准确地切断神经元在体内,并引起了类似再生反应1,3,7。

我们目前在体内的激光干切断表演的协议,在使用MicroPoint脉冲激光,交钥匙系统,是现成的,并已被广泛用于细胞进行有针对性的消融的蠕虫。我们描述的激光对准,安装蠕虫,切割特定神经元,并评估后续再生。该系统提供的能力在一项实验中削减多个蠕虫的神经元大量。因此,激光干切断本文所述的是一个高效的系统启动和分析的再生过程。

Protocol

1。组装系统

下面列出了我们系统的具体组成部分。正确组装时,用户应该能够集中精力,用一只手的显微镜,将与其他阶段(或者用鼠标或操纵杆),激活与脚踏板的激光,并有一个明确的说法屏幕图像。

  1. MicroPoint激光装到一个复式显微镜落射荧光港口。我们使用尼康80I,但任何研究级直立或倒置的范围应工作。 MicroPoint系统将包括一个自定义的分色,这应该与荧光标记的细胞,你希望削减。切割与替代荧光团标记的细胞额外dichroics。此外,脉冲发生器和脚踏板来与MicroPoint系统。
  2. 100倍,1.4 NA手术和评估再生石油的目标,再加上必要的额外的目标定位在幻灯片上的样品。我们对手术中使用尼康计划阿婆VC,发现粗的重点,发现样品,4X是有用的。
  3. 机动与操纵杆的阶段。具有极高的精度和可重复性的一个阶段是不必要的,因为只为目标阶段。我们使用之前OPTISCAN II(见讨论)。
  4. 相机。相机的需求,以提供足够的帧速率,标记的突起与100X目标,重点和目标,而可视化在计算机显示器上的形象。我们喜欢干切断过程的衰减过程中的照明灯,从照片褪色或损坏(见,低于1.7),以避免潜在的混杂影响。因此,相机的需求不够敏感,以适应这种减少光照水平。我们使用滨松ORCA 05G,并发现,在16.3赫兹成像足够。同样的相机可以被替换。
  5. 计算机,显示器和图像处理软件,可以驱动摄像头。此外,我们使用图像处理软件,用鼠标操作的机动阶段(见讨论)。
  6. 空气球台。此要求可能会有所不同位置而有所不同,但因为手术是用100X目标,我们发现振动隔离是必不可少的。
  7. 光照明的荧光光导和快门机制供应。光导会重视的MicroPoint。快门机制是很有用的独立的激光,以减少光照强度的。我们使用一个200流明之前或徕卡EL6000,衰减高达80%的总的光强度为干切断。

2。激光设置

MicroPoint激光系统提供一个详细的协议,初步调整和重点激光。我们假设一直遵循这一程序在初始安装成功。这包括使在目镜的十字线激光。在这里,我们提供了一个协议定期保养激光的重点和力度。

在MicroPoint手册中指出,脉冲氮激光是严重损害人的眼睛的能力。应小心,切勿直视激光束直接。一旦安装完毕,应安全地阻止屏障过滤器通过目镜辐射。

一粒沙子的大小,切割在一个生物体的神经细胞可以是具有挑战性。由于激光所造成的损害的面积很小,这是必须要知道,正是以目标样本三维激光的焦点位置。激光的重点是发现使用镜像幻灯片。首先,我们检查,激光聚焦的Z位置相匹配的成像路径的焦点。下一步,XY位置的损害的重点是与成像软件十字线标记。

重点在z平面

  1. 推中性密度滤光镜ND16(图1a)。我们使用中性密度滤光片,在外延照明路径衰减的激光,同时注重。更精细的重点,推动两个ND16和ND4基因荧光过滤器。
  2. 与交换机的设置MicroPoint 1个脉冲的激光打开“选择”(图1b),然后移动过滤器轮适当的通长的屏障过滤器(图1c)。
  3. 将在舞台上的镜像的幻灯片和4X使用透射光的目标集中在它的针孔。
  4. 浸油下降到镜像的幻灯片,并重新调整与100X目标的针孔。打开相机的快门与光开关杆(图1d)和激光快门(图1e)的路径。如果有必要,减少透射光强度,使针孔边缘清晰:这将有助于完全集中。
  5. 按下脚踏板。这应该产生一个在镜子里的小洞,如果激光聚焦正确。
  6. 略高于平面镜像幻灯片聚焦显微镜,并再次发射激光。这应该使一个更小的孔比第一枪,或没有留下任何印记。重复下面的镜像幻灯片的重点。
  7. 如果没有一个洞是在2.5,如果高于或低于重点镜面时产生一个更大的洞,重新调整与激光消融头的对焦环。验证该洞仍然是正确与目镜十字线对准。 z平面的重点一致的使用,很少需要进行调整。

聚焦在XY平面上

  1. 按照2.1到2.3以上的步骤,并按下脚踏板,使镜中的幻灯片的一个小孔。
  2. 启动“活”捕捉模式从要素“收购”菜单。在“测量”工具栏上选择“投资回报率主编的”,然后选择“双十字”工具拖动十字线,以配合新孔的中心。点击“保存的投资回报率”,然后“退出编辑器”,并恢复实时捕捉模式。
  3. 激活元素中的“设置鼠标的XY”,用鼠标操作的阶段。
  4. 中性密度​​滤光镜(S)拉回到原来的位置(S),到10集的激光脉冲,并删除镜像幻灯片。

调整激光功率

  1. 应调整,以减少您所选择的神经元所需的最低功率的激光功率。调整移动衰减器板(图1F),同时削减生活蠕虫(如下所述)的功率。如果激光功率过高,它会引起周围的损害或爆炸蠕虫洞。如果激光功率过低,不会切断神经元。一旦系统已成立,衰减器的位置很少需要改变。如果激光变弱,需要衰减器板块移动继续切割,它可能是一个迹象,需要更换(见讨论),染料在染料细胞。

3。固定的蠕虫

  1. 准备了3%M9的熔融在琼脂糖(磷酸二氢钾22MM,42MM的Na2HPO4,85MM氯化钠,硫酸镁1MM)的解决方案。分送熔化琼脂糖5毫升到15毫升猎鹰管。填写另一个管水。放置在一个模块化的加热元件管设置为55 ° C装满水的加热元件来创建每管的微型水浴。注:琼脂糖可以提前准备大量的后续实验重新回炉。
  2. 每两张幻灯片,这些幻灯片之间的一个干净的幻灯片放在两层标签磁带。分配一个干净的幻灯片和另一张幻灯片的第一次,造成的琼脂糖凝胶垫使是两件磁带的厚度(图2)垂直的中间用一个塑料球吸管琼脂糖下降。从垫在30秒后取出两张幻灯片。冲洗和存放在装满水的猎鹰管与随后的幻灯片使用的塑料吸管。
  3. 下一步,放置3-5微升0.10微米或0.05微米的聚苯乙烯珠垫的中心。添加感兴趣的神经元中表达荧光蛋白的5-10蠕虫。如果感兴趣的神经元是不对称分布的右边或左边的蠕虫,使用铂金拿起,翻转,使正确的一面是朝上的蠕虫。蠕虫必须放在准备琼脂糖垫在10分钟的幻灯片。
  4. 小心地将盖玻片上的蠕虫。放置盖玻片后,不要动它相对的琼脂糖凝胶垫,因为这会破坏角质层和破坏的蠕虫。放置在显微镜舞台上的准备幻灯片。

4。切断神经元

  1. 光线直接进入光路切换杆的目镜。重点要削减与4X目标的蠕虫,地方的盖玻片上的油下降,并切换到100X的目标。返回到相机的光路。
  2. 使用鼠标移动到您所选择的神经元,下十字线的中心。按脚踏火激光切断的神经元的过程。如果需要,可以使用两套脉冲切断的神经元。首先,它是有帮助的精确跟踪神经元有个别蠕虫切断,以评估后续再生。当正确执行,激光干切断生产不造成重大损害周围的皮肤组织或其他神经元(见图3)的情况下一个神经元的小破。在某些情况下,可能会形成一个小的疤痕周围损伤的部位。
  3. 收回的蠕虫取出盖玻片直接向上运动,小心蠕虫琼脂糖垫。不要滑动盖玻片。然后,切开尖嘴钳的蠕虫周围垫和放置新鲜种子NGM板OP50 8节琼脂糖。放在垫10μL无菌M9摆脱珠的蠕虫和去除琼脂糖。

5。分数再生神经元

  1. 在步骤2.2中所述,准备琼脂糖垫。
  2. 在3-5及广场的蠕虫万亩; L的聚苯乙烯珠。应用盖玻片。可以按顺序准备幻灯片,或者所有的蠕虫可以在推进,并保持在10厘米的培养皿中,每个都含有保持琼脂糖湿润潮湿Kimwipe幻灯片准备。
  3. 使用100X的目标形象化切断的神经元。在许多神经元,神经断端远端切站点将保持不变。我们使用这残余的存在,作为一个神经元确实切断(图4)的指示。这个残端的存在,使我们能够区分出已被切断,从一个不会削减再生神经元。注:无论是远端和近端的树桩最初被切断后收回。
  4. 评估再生。各种参数才能确定。一个简单的实验是受伤的神经元是否已形成一个生长锥(图4a)和再生的,或不(图4b)。此外,突起的长度可以被追踪和比较。

6。代表性的成果

作为一个例子,我们描述的γ-氨基丁酸(GABA)的运动神经元再生的特性。这些神经元,其中居住在腹神经索和扩展过程圆周背神经索,是必要的适当运动9。 GABA的神经细胞可以表达一个基因编码的荧光基团,如绿色荧光蛋白(GFP),可视化,控制下联合国军司令部 -47或UNC的-25促销员(株EG1285和CZ1200, 分别可从线虫遗传中心)。

山L4阶段蠕虫描述的那样,翻转蠕虫,所以在他们的左右两侧的GABA神经元朝上,并将其放置盖玻片。切割后,在每一个蠕虫病毒,背,腹线之间的中途commissures 1-3。避免削减commissures交叉或与其他commissures,因为这些fasciculate以后难以得分。恢复所述的蠕虫。

一个成功的干切断后18至24小时,蠕虫会从手术中恢复,并表现出正常的locomotory和产蛋行为。丢弃死亡或生病的蠕虫。重新装入其余部分所描述的那样,评估再生。我们通常的目的是评估至少有30%的实验条件下切断神经元。 oxIs12动物,切断L4 GABA的神经元通常是60-70%,将发起一个生长锥的结构,扩大膜的一角和几个突起分行的延伸,并从削减站点(图4a)迁移证明。在许多情况下,生长锥​​将迁移到重新与背神经索,相邻的神经元合缝,或远侧断端。其余30%的神经元将发起没有增长,形成一个树桩近端干切断网站,或将延长只小的丝状伪足(图4b)。

图1
图1。紫外线脉冲激光干切断系统 。具体内容是:(一)ND滤镜(二)脉冲选择(C)滤光轮杆(D)光路开关杆(E)激光快门和(F)衰减器板。

图2
图2。准备琼脂糖垫 。为了准备所需的厚度的琼脂糖垫,两层胶带(绿色)被放置在两个幻灯片。前两个幻灯片之间放置,和琼脂糖下降,然后添加到干净的幻灯片。最后,第四个幻灯片是垂直放置的前三个,导致在一垫就是两件磁带的厚度。

图3
图3。代表GABA的神经元axotomies。在一个典型的实验中,GABA的神经元commissures蠕虫的侧面中间被切断。一个割断合缝立即前(左图)和(右图)干切断后。 100X油目标所采取的所有图像。

图4
图4。 GABA的神经元axotomies代表性的结果 。 24小时后干切断切断轴突再生取得。与再生轴突的生长锥(箭头)(a)在非再生轴突近端残端(箭头)(b)中所示。每个切断轴突的远侧断端显示在每个面板(箭头),是轴突被切断的迹象。

Discussion

各种激光系统已被用于削减 C突起在详细3,7,10,11研究他们的表现, 线虫和一些研究。 MicroPoint在我们​​的协议中使用的激光是一个交钥匙系统,容易设置和维护,并以较低的成本相比,一个钛蓝宝石激光系统的研究人员提供。然而,一个钛蓝宝石系统相比,预计MicroPoint激光造成损坏面积较大,这可能对一些应用程序不利。如果需要一个钛蓝宝石系统,建设这样一个系统的一个很好的协议提供12。

目前的协议,可以执行各种不同的神经元在C 线虫 ,但是,我们注意到,在不同类型的神经元之间的再生能力的差异预计13。此外,不同的基因背景可以影响再生成功。虽然GABA的神经元再生的比例是相当不同的转基因标记菌株之间的一致,我们已经注意到在再生的整体 略有增加 oxIs12 15蠕虫juIs76 14。触摸神经元的标记之间的差异被描述2。

我们喜欢固定与微球,而不是麻醉药的蠕虫,如珠导致更快和更一致固定16。这也是有利的,因为我们能够观察到任何可能由于麻醉17混杂影响的再生。另一种麻醉无固定的方法是使用微流体装置。已被广泛使用干切断微流体描述17-22。

我们发现,一致的使用,激光功能的最佳时香豆素染料单元440改为每周一次以下MicroPoint手册中所述的程序。如果有必要,可以使用衰减滑块,增加功率,但是这可能是一个旧的染料或激光错位的迹象。此外,染料的细胞有一个有限的寿命,并最终将需要进行重建或替换(请参阅排除)。

它可能很难操纵下十字线,标志着激光聚焦的目标突起,特别是如果动物是不完全瘫痪。我们发现,手工阶段是不为这一目的的最佳,但它肯定是可用。一个操纵杆控制机动阶段是更精确,我们发现,使用的软件,支持图像拖动鼠标移动的机动阶段是最好的。尼康元素提供此功能,并在本协议中所述,但事无巨细的免费软件包,以及其他图像处理软件,可能也有类似的功能。精细定位的一个不同的方式,是将激光聚焦,而不是动物。阿振光束控制机制可作为一个MicroPoint激光添加,如果这种方法是首选。

除了 ​​神经再生的研究及其应用,激光可用于消融其他类型的细胞,如皮肤,肌肉,或专门的细胞,或破坏特定的神经突触23-27。此外,规范附带伤害或疾病的神经元退化的途径,这个系统可以进行调查。因此,使用脉冲激光器将继续揭示遗传因素和细胞生物学的变化,促进神经再生和其他相关进程。

故障排除:

这里描述的一些常见问题及其相关的解决方案。

  1. 激光切割不正确 。这可能是因为无论是激光的重点(见第2节),或染料在染料细胞需要更换(见MicroPoint手册)。另外,染料电池可能需要更换或重建。
  2. 蠕虫正在琼脂糖垫 。这通常是一个符号,琼脂糖垫太潮湿。我们发现垫需要约30秒钟,而后虫放在他们绕过这个问题。您也可以尝试使用较小的尺寸(0.05微米)微球。
  3. 蠕虫的恢复是困难和效率低下。这可能是造成不正确的盖玻片拆除或干琼脂糖垫。如果垫过于干燥,您可能会注意到轴突发展串珠的外观。在某些情况下,这是因为蠕虫不放在垫后,它是很快。另外,老股票的琼脂糖溶液可能有反复融化后的浓度高于3%。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

在Hammarlund实验室的工作是由美国国立卫生研究院拨款R01 NS066082 - 01和T32GM007223,贝克曼基金会和埃利森医学基金会。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05 μm Polystyrene Beads Polysciences, Inc. 08691
0.10 μm Polystyrene Beads Polysciences, Inc. 00876
Agarose GPG/LE American Bioanalytical 00972 Ultra pure
Falcon 14 ml Polystyrene Round-Bottom Tube BD Biosciences 352057 17 x 100 mm style, nonpyrogenic
Thermo Scientific Plain precleaned microscope slides Erie Scientific 420-004T 3" x 1" x 1 mm
Cover Slips VWR international 48366 205 18 mm x 18 mm No. 1 1/2
KIMTECH Science Kimwipes Kimberly-Clark Corporation 34155
BD Falcon 100 x 15mm Style Petri Dish BD Biosciences 351029
Tape blank 3/4w x 500L TimeMed T-512
Immersion oil Nikon Instruments Type A, nd=1.515
EG1285 or CZ1200 Caenorhabditis Genetics Center http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/
OptiScan II Prior Scientific
NIS-Elements Ar or Br Nikon Instruments
MicroPoint Ablation Laser System Photonic Scientific
Compound microscope Nikon Instruments Eclipse 80i
Hamamatsu Camera Hamamatsu Corp. Model C8484-05G01
Dell Precision T3400 PC with Intel Core 2 Duo Dell
Windows XP Professional Microsoft Version 2002, Series Pack 3
Dual dry bath Incubator Fisher Scientific Analog controls
4X Plan Fluor objective Nikon Instruments
100X Plan Apo VC oil objective Nikon Instruments
Dumont #5/45 forceps Dumont 11251-35 Dumoxel standard tips, can also use #7
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ800 With NI-150 High Intensity Illuminator

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References

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神经科学杂志,第51期,线虫,干切断,再生,GABA的神经元,脉冲激光,在体内
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Byrne, A. B., Edwards, T. J.,More

Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707, doi:10.3791/2707 (2011).

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