Summary
Beschrijven we een protocol voor de fabricage van microfluïdische apparaten die cel te vangen en cultuur kunnen inschakelen. In deze benadering patroon microstructuren, zoals groeven in microfluïdische kanalen worden gebruikt om lage shear stress regio's waarbinnen de cel kan dock te creëren.
Abstract
Beschrijven we een microfluïdische apparaat met microgrooved patronen voor het bestuderen van cellulaire gedrag. Deze microfluïdische platform bestaat uit een top vloeibare kanaal en een bodem microgrooved substraat. Te fabriceren van de microgrooved kanalen, was een top poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) mal met de indruk van de microfluïdische kanalen op elkaar afgestemd en gebonden aan een microgrooved substraat. Met behulp van dit apparaat, de muis fibroblast cellen werden geïmmobiliseerd en patronen binnen de microgrooved substraten (25, 50, 75 en 100 micrometer breed). Om apoptose in een microfluïdische apparaat studie, was de media die waterstof peroxide, Annexine V en propidiumjodide doorbloed in de vloeibare kanaal voor 2 uur. We vonden dat de cellen blootgesteld aan de oxidatieve stress apoptotische werd. Deze apoptotische cellen werden bevestigd door Annexine V die gebonden aan phosphatidylserine bij de buitenste leaflet van de plasmamembraan tijdens het apoptose-proces. Met behulp van deze microfluïdische apparaat met microgrooved patronen, was het apoptose-proces waargenomen in real-time en geanalyseerd met behulp van een omgekeerde microscoop met een incubatiekamer (37 ° C, 5% CO 2). Daarom kon dit microfluïdische apparaat opgenomen met microgrooved substraten nuttig zijn voor het bestuderen van de cellulaire gedrag en het uitvoeren van high-throughput screening van geneesmiddelen.
Protocol
A. microfabricage van de microfluïdische apparaat
- 4-inch Si wafer is behandeld met reactieve zuurstof plasma (5 min op 30W, Harrick Scientific, NY).
- Negatieve fotolak (SU-8 2015, Microchem, MA) is spin-coating bij 900 rpm gedurende 1 minuut op een Si wafer.
- De wafer is zacht gebakken op 95 ° C gedurende 6 minuten op een kookplaat en wordt blootgesteld aan UV-licht (200W) voor 4 min via een masker film met microkanalen.
- De wafer is na de gebakken op 95 ° C gedurende 6 minuten en is ontwikkeld met behulp van SU-8 fotolak ontwikkelaar.
- De fotolak patroon wafer met microkanalen is geplaatst in een Petri-schaal.
- Poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) (Sylgard 184) mallen worden vervaardigd door het mengen van silicone-elastomeer en verharder (10:1 ratio).
- De PDMS mengsel wordt uitgegoten op de Si meester mal en wordt geplaatst op een vacuümexsiccator om bellen te verwijderen.
- PDMS is uitgehard bij 70 ° C gedurende 1 ~ 2 uur.
- PDMS mallen worden vervolgens afgepeld van de Si meester mal.
B. Montage van het apparaat
- 40 um dikke top vloeibare-kanalen en 40 um dikke bodem microgrooved kanalen (25, 50, 75 en 100 μ m breed) zijn verkregen uit twee verschillende Si meester schimmels.
- Kanaal-en uitlaat van de vloeibare apparaat zijn gestanst.
- Vloeibare kanalen en Microgroove kanalen worden onherroepelijk gebonden door de reactieve zuurstof plasma (5 min op 30W, Harrick Scientific, NY).
- Extracellulaire matrix (ECM) (dwz fibronectine) is gecoat in microfluïdische apparaat gedurende 1 uur in de broedstoof (37 ° C).
C. Cel zaaien en de experimentele opstelling
- NIH-3T3 muis fibroblasten worden gekweekt in een fles met behulp van weefselkweek Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS).
- Cellen worden getrypsiniseerd en gedissocieerd.
- Gescheiden cellen worden geladen in de Microgroove kanalen in de cel dichtheid van 3 × 10 6 cellen / ml (Figuur 1).
Figuur 1
- 2 ml media, 100 mm H 2 O 2, en apoptose assay (20 pL Annexine V en 40 uL propidiumjodide, Invitrogen, CA) worden toegediend in een kanaal met behulp van een injectiepomp (1 pl / min).
- Cellen worden real-time gemonitord met behulp van een omgekeerde microscoop (Nikon TE 2000).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellen werden geïmmobiliseerd en patronen binnen de microgrooved substraten in een microfluïdische apparaat. Het proces van apoptose cellen blootgesteld aan waterstofperoxide werd waargenomen in real-time en geanalyseerd met behulp van Annexine V en propidiumjodide. Zo zou deze microfluïdische apparaat met Microgroove kanalen bruikbaar zijn voor high-throughput screening van geneesmiddelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) |
| DMEM | medium | Invitrogen | 11965 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Media |
| FBS | serum | Invitrogen | 10082-147 | Fetal Bovine Serum |
| Hydrogen peroxide | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Apoptosis assay | Invitrogen | V13242 | Annexin A, propidium iodide | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 2015 | ||
| Si wafer | Tool | 4 inch silicone wafer | ||
| Reactive oxygen plasma | Reagent | Harrick Scientific Products, Inc. | treat wafer 5 min at 30W | |
| inverted microscope | Tool | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
- Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
- Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).
