Summary
우리는 세포 캡처 및 문화를 활성화할 수 있습니다 microfluidic 장치의 제조를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는 이러한 microfluidic 채널 내에서 홈과 같은 패턴 microstructures는 셀 수있는 부두 내에서 낮은 전단 응력 영역을 작성하는 데 사용됩니다.
Abstract
우리는 세포 행위를 연구에 대한 microgrooved 패턴과 microfluidic 장치를 설명합니다. 이 microfluidic 플랫폼은 최고의 유체 채널 및 하단 microgrooved 기판으로 구성되어 있습니다. microgrooved 채널을 조작하려면, microfluidic 채널의 인상을 포함하는 최고의 폴리 (dimethylsiloxane) (PDMS) 몰드는 정렬과 microgrooved 기판에 접착했습니다. , 마우스 fibroblast 세포가 (25, 50, 75, 100 μm의 폭) 고정 및 microgrooved 기판 내에 패턴했다이 장치를 사용합니다. microfluidic 장치에서 apoptosis를 공부하려면, 과산화수소, Annexin V 및 propidium 요오드화물의를 포함하는 미디어는 2 시간 동안 유체 채널로 perfused되었습니다. 우리는 산화 스트레스에 노출된 세포가 apoptotic 된 것으로 나타났습니다. 이러한 apoptotic 세포는 apoptosis 과정에서 플라즈마 막의 바깥쪽 전단지에 phosphatidylserine로 바운드되는 Annexin V에 의해 확인되었다. microgrooved 패턴이 microfluidic 장치를 사용하여 apoptosis의 과정은 실시간으로 관찰 및 배양 챔버 (37 ° C, 5 % CO 2)를 포함 거꾸로 현미경을 사용하여 분석되었다. 따라서, microgrooved 기판과 통합이 microfluidic 장치는 세포 행동을 공부하고 높은 처리량 약물 검사를 수행하는 데 유용 수 있습니다.
Protocol
microfluidic 장치의 A.의 Microfabrication
- 4 인치 웨이퍼는시 반응 산소 플라즈마 (30W, Harrick 과학에서 5 분, NY)로 처리됩니다.
- 부정적인 포토 레지스트 (SU - 8 2015, Microchem, MA)는시 웨이퍼 1 분 900 rpm으로 스핀 - 코팅입니다.
- 웨이퍼는 부드럽 95에서 구운 ° C가 열판에 6 분 및 microchannels를 포함하는 마스크 필름을 통해 4 분에 대한 자외선 (200W)에 노출됩니다.
- 웨이퍼 95에서 구운 게시물 ° C 6 분 및 SU - 8 포토 레지스트 개발를 사용하여 개발된 것입니다. 것입니다
- microchannels를 포함하는 포토 레지스트 패턴 웨이퍼는 페트리 접시에 - 배치됩니다.
- 폴리 (dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) 금형은 혼합 실리콘 엘라스토머 및 치료 에이전트 (10시 1분 비율)에 의해 가공됩니다.
- PDMS 혼합물은시 마스터 몰드에 붓고하고 거품을 제거하는 진공 건조기에 배치됩니다.
- PDMS는 1 ~ 2 시간 동안 70 ° C에서 치료됩니다.
- PDMS 금형은 다음시 마스터 금형으로부터 떨어져 벗겨 수 있습니다.
B.이 장치를 조립
- 40 μm의 두께가 상단 유체 채널 및 40 μm의 두께 하단 microgrooved 채널 (25, 50, 75, 100 μ m 폭) 두 개의 서로 다른시 마스터 금형으로부터 얻을 수 있습니다.
- 유체 장치의 채널 입구와 출구는 펀치입니다.
- 유체 채널과 마이크로 그루브 채널 irreversibly 반응 산소 플라즈마 (30W, Harrick 과학에서 5 분, NY)에 의해 결합됩니다.
- 세포외 매트릭스 (ECM) (즉, fibronectin)는 인큐베이터에서 1 시간 (37 ° C)에 대한 microfluidic 장치 내부에 코팅됩니다.
C. 셀 시딩 및 실험 설정
- NIH - 3T3 섬유아 세포는 마우스 10% 태아 소 혈청 (FBS)이 포함된 Dulbecco의 수정된 이글의 미디어 (DMEM)을 사용하여 조직 배양 플라스크에 양식 있습니다.
- 세포가 trypsinized 및 dissociated 있습니다.
- Dissociated 세포는 3 셀 밀도 × 10 6 세포 / ML (그림 1)에서 마이크로 그루브 채널로로드됩니다.
그림 1
- 2 ML 미디어, 100 MM H 2 O 2, apoptosis 분석 (20 μL Annexin V 40 μL propidium의 요오드화물, Invitrogen, CA)를 주사기 펌프 (1 μl / 분)을 사용하여 채널에 들어갈 수 있습니다.
- 세포는 거꾸로 현미경 (니콘 TE 2000)를 사용하여 모니터링 실시간 있습니다.
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Discussion
전지 microfluidic 장치에서 고정 및 microgrooved 기판 내에 패턴했다. 과산화수소에 노출 세포의 apoptosis 과정이 실시간으로 관찰 및 Annexin V 및 propidium 요오드화물의를 사용하여 분석되었다. 따라서, 마이크로 그루브 채널을 포함하는이 microfluidic 장치는 높은 처리량 약물 검사에 유용 수 있습니다.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) |
| DMEM | medium | Invitrogen | 11965 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Media |
| FBS | serum | Invitrogen | 10082-147 | Fetal Bovine Serum |
| Hydrogen peroxide | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Apoptosis assay | Invitrogen | V13242 | Annexin A, propidium iodide | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 2015 | ||
| Si wafer | Tool | 4 inch silicone wafer | ||
| Reactive oxygen plasma | Reagent | Harrick Scientific Products, Inc. | treat wafer 5 min at 30W | |
| inverted microscope | Tool | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
- Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
- Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).
