Summary
Мы опишем протокол для изготовления микрожидкостных устройств, которые могут позволить захват клеток и культуры. При таком подходе узорной микроструктур, таких как пазы внутри микрожидкостных каналов используются для создания низкого напряжения сдвига регионов, в которых клетка может дока.
Abstract
Мы описываем микрожидкостных устройств с microgrooved моделей для изучения сотовой поведения. Это микрожидкостных платформа состоит из верхней жидкостный канал и нижней microgrooved подложки. Для изготовления microgrooved каналов, топ поли (диметилсилоксана) (PDMS) плесень содержащие впечатление микрожидкостных каналов, был согласован и связан с microgrooved подложки. С помощью этого устройства, клеток фибробластов мыши не могли двигаться и рисунком в microgrooved субстраты (25, 50, 75 и 100 мкм в ширину). Для изучения апоптоза в микрожидкостных устройств, сред, содержащих перекись водорода, Аннексин V, и пропидий иодида перфузии в жидкостный канал на 2 часа. Мы обнаружили, что клетки подвергаются окислительному стрессу стал апоптоза. Эти апоптотических клеток были подтверждены Аннексин V которая привязана к фосфатидилсерина в наружный листок из плазматической мембраны в процессе апоптоза процесса. С помощью этого устройства с микрожидкостных microgrooved узоры, апоптоз процесс наблюдался в режиме реального времени и проанализированы с помощью инвертированного микроскопа, содержащая камеру инкубации (37 ° C, 5% СО 2). Таким образом, этот микрожидкостных устройство, установленное с microgrooved подложки могут быть полезны для изучения клеточного поведения и выполнения высокой пропускной скрининга препаратов.
Protocol
А. микротехнологий из микрожидкостных устройств
- 4-дюймовый пластины кремния обрабатывают реактивные кислородной плазмы (5 мин при 30 Вт, Harrick Научные, Нью-Йорк).
- Отрицательные фоторезиста (ГУ-8 2015 года, Microchem, MA) является спин-покрытие в 900 оборотов в минуту в течение 1 мин на пластины кремния.
- Пластины мягкой запеченный при температуре 95 ° С в течение 6 мин на плиту и подвергается воздействию ультрафиолетового излучения (200 Вт) в течение 4 мин через маску пленку, содержащую микроканалов.
- Пластины сообщение запеченный при температуре 95 ° С в течение 6 мин и разработан с использованием SU-8 фоторезиста разработчика.
- Фоторезиста узорной пластины содержащей микроканалов помещается в Петри-блюдо.
- Поли (диметилсилоксана) (PDMS) (Sylgard 184) формы изготавливаются путем смешивания эластомера силикона и отвердителя (10:1).
- Смесь PDMS выливают на плесень мастер Si и находится на вакуумном эксикаторе, чтобы удалить пузырьки.
- PDMS отверждается при температуре 70 ° С в течение 1 ~ 2 часа.
- PDMS формы, затем снимают с формы мастер Si.
Б. Сборка устройства
- 40 мкм верхней жидкостных каналов и 40 мкм толстым дном microgrooved каналы (25, 50, 75 и 100 μ м в ширину) получаются из двух различных мастер формы Si.
- Канал входе и выходе устройства жидкостный пробиваются.
- Fluidic каналов и каналов микроканавка необратимо связанных с реактивной кислородной плазмы (5 мин при 30 Вт, Harrick Научные, Нью-Йорк).
- Внеклеточного матрикса (ECM) (т.е. фибронектин) покрыты внутри микрожидкостных устройств в течение 1 часа в инкубатор (37 ° С).
С. посева клеток и экспериментальной установки
- NIH-3T3 фибробластов мыши культивировали в колбе ткань культуры с помощью СМИ Дульбеко изменения Орла (DMEM), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
- Клетки трипсином и диссоциирован.
- Расхождение между клетками загружаются в микроканавка каналов на плотность клеток в 3 × 10 6 кл / мл (рис. 1).
Рисунок 1
- 2 мл СМИ, 100 мМ H 2 O 2 и апоптоз анализа (20 мкл Аннексин V и 40 мкл йодида пропидий, Invitrogen, CA), которые вливаются в канал с помощью шприцевой насос (1 мкл / мин).
- Клетки в режиме реального времени контролировать с помощью инвертированного микроскопа (Nikon TE 2000).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Клетки иммобилизованных и рисунком в microgrooved субстратов в микрожидкостных устройств. Процесс апоптоза клеток воздействию перекиси водорода наблюдалось в реальном времени и проанализированы с помощью Аннексин V и пропидий йодида. Таким образом, это устройство, содержащее микрожидкостных микроканавка каналов может быть полезна для высокопроизводительного скрининга препаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) |
| DMEM | medium | Invitrogen | 11965 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Media |
| FBS | serum | Invitrogen | 10082-147 | Fetal Bovine Serum |
| Hydrogen peroxide | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Apoptosis assay | Invitrogen | V13242 | Annexin A, propidium iodide | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 2015 | ||
| Si wafer | Tool | 4 inch silicone wafer | ||
| Reactive oxygen plasma | Reagent | Harrick Scientific Products, Inc. | treat wafer 5 min at 30W | |
| inverted microscope | Tool | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
- Khademhosseini, A., Yeh, J., Eng, G., Karp, J., Kaji, H., Borenstein, J., Farokhzad, O. C., Langer, R. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab Chip. 5, 1380-1386 (2005).
- Whittemore, E. R., Loo, D. T., Watt, J. A., Cotman, C. W. A detailed analysis of hydrogen peroxide-induced cell death in primary neuronal culture. Neuroscience. 67, 921-932 (1995).
