Summary
我们描述了一个协议梯度产生的微流体装置，可以产生良好定义的微环境中的空间和时间的梯度微细。在这种方法中，梯度产生的微流体装置可用于研究细胞定向迁移，胚胎发育，伤口愈合，癌症转移。
Abstract
的制造和研究细胞行为的一个梯度产生的微流体装置的操作说明。微流体平台是一个有利的实验工具，因为它可以精确地操纵流体流动，使高通量的实验，并产生稳定的水溶性的浓度梯度。相比传统的梯度发生器，聚二甲基硅氧烷（PDMS）的基于微流体装置，可以产生生长因子具有良好定义的配置文件稳定的浓度梯度。在这里，我们开发了三个独立的进气口简单的梯度产生的微流体装置。三微合并成一个微产生浓度梯度。 isothyiocyanate荧光素（FITC）-葡聚糖的分子量类似表皮生长因子（EGF），生长因子梯度的稳定和形状被证实。我们表明，使用这种微流体装置，暴露表皮生长因子的浓度梯度成纤维细胞对高浓度的迁移。细胞迁移和细胞迁移运动的方向定位，定量评估细胞跟踪分析。因此，该梯度产生的微流体装置，可能是有益的研究和分析细胞迁移的行为。
Protocol
A.梯度产生的微流体装置微细
- 硅晶片被视为与活性氧离子（Harrick科学30W，5分钟，NY）。
- 负型光刻胶（SU - 8 50，Microchem，MA）是在一个硅晶片上的1分钟1000转的旋涂。
- 晶圆是软的烤在65 ° C为10分钟，随后在95 ° C为30分钟一个电磁炉。
- 晶圆暴露在紫外线灯（200W），通过一个30微米的最小特征尺寸的透明度面具3分钟。
- 晶圆是出炉后在65 ° C为1分，在95 ° C为10分钟。
- 四掌握模具100微米厚的渠道是开发利用SU - 8光刻胶开发。
- 含微晶圆被放置在一个Petri盘。
- 聚二甲基硅氧烷（PDMS）中（Sylgard 184）模具制造混合的有机硅弹性体和固化剂（10:1）。
- 泗母模的PDMS混合物倒入。
- 四母模是放在真空干燥器除去10分钟的气泡。
- PDMS的是固化在70 ° C，1〜2小时。
- 从四母模的PDMS模具揭下。
B.实验装置
- 细胞的入口，出口，并注入进气口的PDMS微设备使用锋利打孔器打孔。
- 是不可逆转的保税的活性氧等离子（Harrick科学30W，5分钟，纽约州）的设备和载玻片（2 × 3英寸）。
- 聚乙烯管（PE 20，流式细胞Dickinon，MD）被插入到微流体装置注入进气口，随后连接到一个注射器泵。
- 异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖（MW = 10kD，10μM，Sigma公司）和缓冲液（PBS，Invitrogen公司，CA）注入到微流体装置内的流体设备，以确认稳定的梯度。
- 培养箱中培养1小时（37℃）的微流体装置内涂外基质（ECM）（即纤维连接蛋白）。
- 的NIH 3T3成纤维细胞，胰酶消化分离。
- 游离细胞被加载到微流体装置（宽800微米），在细胞密度2 × 10 6细胞/ ml 。
- 注入2毫升媒体和50 ng / mL表皮生长因子（EGF）是一个微流体装置，使用注射泵（0.05微升/分钟）生成可溶性梯度。
- 细胞实时监测每5分钟，通过倒置显微镜（尼康TE的2000）。
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Discussion
细胞暴露于稳定的表皮生长因子的浓度梯度，在向着更高浓度的迁移一个微流体装置。细胞跟踪分析，细胞迁移，趋化指数，细胞迁移运动的方向定位进行了调查。因此，该梯度产生的微流体平台可用于研究癌细胞转移，胚胎发育和轴突导向。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | FD10S | Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | human recombinant Epidermal growth factor | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Si wafer | silicone wafer, 4 inch | |||
| Petri dishes | ||||
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectin | ||||
| NIH 3T3 | cell-line | fibroblast cells | ||
| Inverted microscope | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
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