Summary
Beschrijven we een protocol voor de microfabricage van de gradiënt-genererende microfluïdische apparaat dat kan genereren ruimtelijke en temporele gradiënten in goed gedefinieerde micro-omgeving. In deze benadering kan de gradiënt-genererende microfluïdische apparaat worden gebruikt om gerichte celmigratie, embryogenese, wondgenezing, en kanker metastase te bestuderen.
Abstract
De fabricage en de werking van een gradiënt-genererende microfluïdische apparaat voor het bestuderen van cellulaire gedrag wordt beschreven. Een microfluïdische platform is een mogelijk experimenteel instrument, want het kan precies manipuleren vloeistof stroomt, zodat high-throughput experimenten, en het genereren van stabiele oplosbare concentratie gradiënten. Vergeleken met conventionele gradiënt generatoren, poly (dimethylsiloxaan) (PDMS)-gebaseerde microfluïdische apparaten kunnen genereren stabiele concentratie gradiënten van groeifactoren met goed gedefinieerde profielen. Hier hebben we eenvoudige gradiënt-genererende microfluïdische apparaten ontwikkeld met drie aparte ingangen. Drie microkanalen gecombineerd in een microkanaal om de concentratie gradiënten te genereren. De stabiliteit en de vorm van groeifactor gradiënten werden bevestigd door fluoresceïne isothyiocyanate (FITC)-dextran met een moleculair gewicht vergelijkbaar met epidermale groeifactor (EGF). Met behulp van deze microfluïdische apparaat, hebben we aangetoond dat fibroblasten blootgesteld aan de concentratie gradiënten van de EFG-gemigreerd naar hogere concentraties. De gerichte oriëntatie van cel-migratie en de beweeglijkheid van de migrerende cellen werden kwantitatief beoordeeld door cell tracking-analyse. Zo zouden deze gradiënt-genererende microfluïdische apparaat nuttig zijn voor het bestuderen en analyseren van het gedrag van migrerende cellen.
Protocol
A. microfabricage van de gradiënt-genererende microfluïdische apparaat
- De Si wafer is behandeld met reactieve zuurstof plasma (5 min op 30W, Harrick Scientific, NY).
- Negatieve fotolak (SU-8 50, Microchem, MA) is spin-coating bij 1000 rpm gedurende 1 minuut op een Si wafer.
- De wafer is zacht gebakken op 65 ° C gedurende 10 min en vervolgens bij 95 ° C gedurende 30 minuten op een kookplaat.
- De wafer wordt blootgesteld aan UV-licht (200W) voor 3 minuten door middel van een transparant masker met een minimale feature size van 30 micrometer.
- De wafer is na de gebakken op 65 ° C gedurende 1 min en bij 95 ° C gedurende 10 minuten.
- Si meester mal met 100 urn dikke kanalen is ontwikkeld met behulp van SU-8 fotolak ontwikkelaar.
- De wafer met microkanalen is geplaatst in een Petri-schaal.
- Poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) (Sylgard 184) mallen worden vervaardigd door het mengen van silicone-elastomeer en verharder (10:1 ratio).
- De PDMS mengsel wordt uitgegoten op de Si meester mal.
- De Si meester mal wordt geplaatst op een vacuümexsiccator om bellen te verwijderen gedurende 10 minuten.
- PDMS is uitgehard bij 70 ° C gedurende 1 ~ 2 uur.
- PDMS mallen worden afgepeld van de Si meester mal.
B. Experimentele opstelling
- Cel inlaat, uitlaat, en de infusie baaien van de PDMS-gebaseerde microfluïdische apparaat worden geslagen met behulp van scherpe punchers.
- Een apparaat en een glasplaatje (2 x 3 inch) zijn onomkeerbaar gebonden door de reactieve zuurstof plasma (5 min op 30W, Harrick Scientific, NY).
- Polyethyleen buizen (PE 20, Becton Dickinon, MD) wordt ingebracht in de infunderen inlaten van de microfluïdische apparaat en vervolgens aangesloten op een injectiepomp.
- Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran (MW = 10kD, 10 uM, Sigma) en buffer (PBS, Invitrogen, CA) worden toegediend in de microfluïdische apparaat stabiel gradiënten in het vloeibare apparaat te bevestigen.
- Extracellulaire matrix (ECM) (dwz, fibronectine) is gecoat in de microfluïdische apparaat gedurende 1 uur in de broedstoof (37 ° C).
- NIH 3T3 fibroblast cellen zijn getrypsiniseerd en gedissocieerd.
- Gescheiden cellen worden geladen in de microfluïdische apparaat (800 micrometer breed) in de cel dichtheid van 2 × 10 6 cellen / ml.
- 2 ml media en 50 ng / ml epidermale groeifactor (EGF) wordt toegediend in een microfluïdische apparaat voor het genereren van oplosbare verlopen met behulp van een injectiepomp (0,05 ul / min).
- Cellen worden real-time gemonitord om de 5 min met behulp van een omgekeerde microscoop (Nikon TE 2000).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellen blootgesteld aan stabiele concentratie gradiënten van het EFG in een microfluïdische apparaat gemigreerd naar hogere concentraties. De gerichte oriëntatie van celmigratie, chemotactische index, de beweeglijkheid van de migrerende cellen werden onderzocht door de cel-tracking analyse. Daarom kan deze gradiënt-genererende microfluïdische platform nuttig zijn voor het bestuderen van kanker metastase, embryogenese, en axon begeleiding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | FD10S | Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | human recombinant Epidermal growth factor | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Si wafer | silicone wafer, 4 inch | |||
| Petri dishes | ||||
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectin | ||||
| NIH 3T3 | cell-line | fibroblast cells | ||
| Inverted microscope | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
- Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
- Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
