Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Mikrofabrikation der Gradienten-erzeugenden Mikrofluidik-Gerät, das räumliche und zeitliche Verläufe in klar definierten Mikroumgebung erzeugen können. Bei diesem Ansatz kann der Gradient-Erzeugung mikrofluidischen Gerät verwendet, um gerichtete Wanderung, Embryogenese, Wundheilung und Krebs Metastasen zu untersuchen.
Abstract
Die Herstellung und den Betrieb eines Gradienten-erzeugenden Mikrofluidikvorrichtung zur Untersuchung zellulärer Verhalten beschrieben wird. Ein mikrofluidischen Plattform ist ein günstiges experimentelles Werkzeug, weil es genau manipulieren kann Flüssigkeit fließt, ermöglichen einen hohen Durchsatz Experimente und generieren stabile lösliche Konzentrationsgradienten. Im Vergleich zu herkömmlichen Gradienten-Generatoren, Poly (dimethylsiloxan) (PDMS)-basierten mikrofluidischen Bauteilen erzeugen können stabile Konzentrationsgradienten von Wachstumsfaktoren mit gut definierten Profile. Hier haben wir einfache Gradienten-erzeugenden mikrofluidischen Systemen mit drei separaten Eingängen. Drei Mikrokanäle in einem Mikrokanal kombiniert werden, um Konzentrationsgradienten zu erzeugen. Die Stabilität und Form der Wachstumsfaktor-Gradienten wurden durch Fluorescein isothyiocyanate (FITC)-Dextran mit einem Molekulargewicht ähnlich epidermal growth factor (EGF) bestätigt. Mit dieser Mikrofluidikvorrichtung haben wir gezeigt, dass Fibroblasten ausgesetzt Konzentrationsgradienten der EGF zu höheren Konzentrationen migriert. Die Richtungsorientierung der Zellwanderung und die Beweglichkeit der wandernden Zellen wurden quantitativ durch Zell-Tracking-Analyse beurteilt. So könnte dieses Gefälle generierenden Mikrofluidikvorrichtung nützlich sein für das Studium und die Analyse des Verhaltens von wandernden Zellen.
Protocol
A. Microfabrication der Gradienten-erzeugenden Mikrofluidikvorrichtung
- Die Si-Wafer ist mit reaktiven Sauerstoff-Plasma (5 min bei 30W, Harrick Scientific, NY) behandelt.
- Negative Photolack (SU-8 50, Microchem, MA) ist durch Spin-Coating bei 1000 rpm für 1 min auf einem Si-Wafer.
- Der Wafer ist weich gebacken bei 65 ° C für 10 min und anschließend bei 95 ° C für 30 min auf einer Heizplatte.
- Der Wafer wird mit UV-Licht (200W) für 3 min durch eine Transparenz-Maske mit einer minimalen Strukturgröße von 30 pm ausgesetzt.
- Der Wafer wird post bei 65 ° C gebacken für 1 min und bei 95 ° C für 10 min.
- Si Master-Form mit 100 um dicke Kanäle unter Verwendung SU-8 Fotolack-Entwickler.
- Der Wafer mit Mikrokanälen ist in einer Petri-Schale gelegt.
- Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) (Sylgard 184) Formen werden durch Mischen Silikon-Elastomer und Härter (10:1 Verhältnis) hergestellt.
- Die PDMS-Mischung wird auf die Si-Master gegossen.
- Die Si-Master-Form befindet sich auf einem Vakuumexsikkator zu Blasen für 10 min zu entfernen.
- PDMS ist bei 70 ° C für 1 bis 2 Stunden ausgehärtet.
- PDMS Formen werden von der Si Master-Form geschält.
B. Versuchsaufbau
- Zell-Eingang, Ausgang, und die Infusion Buchten der PDMS-basierten mikrofluidischen Gerät mit scharfen punchers gestanzt.
- Eine Vorrichtung und ein Objektträger aus Glas (2 × 3 inch) sind irreversibel durch die reaktive Sauerstoff-Plasma (5 min bei 30W, Harrick Scientific, NY) gebunden.
- Polyethylen-Schlauch (PE 20, Becton Dickinon, MD) wird in die Infusion Buchten der Mikrofluidik-Gerät eingesetzt und anschließend zu einer Spritzenpumpe verbunden.
- Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Dextran (MW = 10kD, 10 uM, Sigma) und Puffer (PBS, Invitrogen, CA) werden in den mikrofluidischen Gerät infundiert, um stabile Gradienten innerhalb des fluidischen Gerät zu bestätigen.
- Extrazellulären Matrix (ECM) (dh, Fibronektin) ist innerhalb der mikrofluidischen Gerät für 1 Stunde im Brutschrank (37 ° C) beschichtet.
- NIH 3T3 Fibroblasten sind trypsiniert und distanziert.
- Dissoziierten Zellen sind in der Mikrofluidik-Gerät (800 &mgr; m breit) an der Zelldichte von 2 × 10 6 Zellen / ml geladen.
- 2 ml Medium und 50 ng / ml epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ist in einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Erzeugung von löslichen Gradienten unter Verwendung einer Spritzenpumpe (0,05 ml / min) infundiert.
- Die Zellen werden in Echtzeit alle 5 min mit einem inversen Mikroskop (Nikon TE 2000) überwacht.
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Discussion
Cells um stabile Konzentrationsgradienten der EGF in einer mikrofluidischen Vorrichtung zu höheren Konzentrationen migriert ausgesetzt. Die Richtungsorientierung der Zellmigration, chemotaktische Index, Motilität wandernden Zellen wurden durch Zell-Tracking-Analyse untersucht. Daher könnte dieses Gefälle generierenden mikrofluidischen Plattform nützlich sein Studium Krebsmetastasen, Embryogenese und Axon Führung.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | FD10S | Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | human recombinant Epidermal growth factor | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Si wafer | silicone wafer, 4 inch | |||
| Petri dishes | ||||
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectin | ||||
| NIH 3T3 | cell-line | fibroblast cells | ||
| Inverted microscope | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
- Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
- Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
