Summary
우리는 잘 정의된 microenvironment의 공간 및 시간적 그라디언트를 생성할 수있는 그라디언트 생성 microfluidic 장치의 microfabrication을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 그라디언트 생성 microfluidic 장치가 감독 셀 마이 그 레이션, embryogenesis, 상처 치유, 및 암 전이를 공부하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
세포 행위를 연구에 대한 제조 및 그라디언트 생성 microfluidic 장치의 작동을 설명합니다. 그것이 정확하게, 유체 흐름을 조작하는 높은 처리량 실험을 활성화하고 안정적인 용해 농도 그라디언트를 생성할 수 있기 때문에 microfluidic 플랫폼, 활성화 실험 도구입니다. 기존의 기울기 발전기, 폴리 (dimethylsiloxane) (PDMS)에 비해 기반의 microfluidic 장치는 잘 정의된 프로필 성장 요인의 안정적인 농도 기울기를 생성할 수 있습니다. 여기, 우리는 별도의 세 가지 인레츠와 간단한 그라디언트 생성 microfluidic 장치를 개발했다. 세 microchannels은 농도 기울기를 생성 한 microchannel에 결합. 성장 인자의 그라디언트의 안정성과 형태는 표피 성장 인자 (EGF)와 비슷한 분자량과 플루오레신 isothyiocyanate (FITC) - dextran에 의해 확인되었다. 이 microfluidic 장치를 사용하여, 우리는 EGF의 농도 기울기에 노출된 섬유아 세포가 높은 농도쪽으로 마이 그 레이션 것을 보여주었다. 마이 그 레이션 세포의 세포 마이 그 레이션 및 운동성의 방향 방향은 양적 세포 추적 분석에 의해 평가되었다. 따라서,이 그라디언트 생성 microfluidic 장치 마이 그 레이션 세포의 동작을 연구하고 분석을 위해 유용할 수 있습니다.
Protocol
그라디언트 생성 microfluidic 장치의 A.의 Microfabrication
- 시 웨이퍼는 반응 산소 플라즈마 (30W, Harrick 과학에서 5 분, NY)로 처리됩니다.
- 부정적인 포토 레지스트 (SU - 8 50 Microchem, MA)가시 웨이퍼 1 분 1,000 RPM에서 스핀 - 코팅입니다.
- 웨이퍼는 부드럽 65 구운 ° 95시 이후에 10 분 및 들면 C ° 열판 30 분 C.
- 웨이퍼 30 μm의 최소 기능 크기가 투명 마스크를 통해 3 분위한 자외선 (200W)에 노출됩니다.
- 웨이퍼 65에서 구운 게시물 ° 1 분 및 95에서 C ° 10 분 C. 것입니다
- 100 μm의 두께 채널시 마스터 금형은 SU - 8 포토 레지스트 개발을 사용하여 개발되고 있습니다.
- microchannels를 포함하는 웨이퍼는 페트리 접시에 - 배치됩니다.
- 폴리 (dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) 금형은 혼합 실리콘 엘라스토머 및 치료 에이전트 (10시 1분 비율)에 의해 가공됩니다.
- PDMS 혼합물은시 마스터 금형에 부어있다.
- 시 마스터 금형 10 분 거품을 제거하는 진공 건조기에 배치됩니다.
- PDMS는 1 ~ 2 시간 동안 70 ° C에서 치료됩니다.
- PDMS 금형은시 마스터 금형으로부터 떨어져 벗겨 수 있습니다.
B. 실험 설정
- PDMS 기반 microfluidic 장치의 세포 유입, 아울렛, 그리고 일으키는 인레츠는 날카로운 punchers를 사용하여 천공하고 있습니다.
- 장치 및 유리 슬라이드 (2 × 3 인치) irreversibly 반응 산소 플라즈마 (30W, Harrick 과학에서 5 분, NY)에 의해 결합됩니다.
- 폴리에틸렌 튜브 (PE 20 백톤 Dickinon, MD)은 microfluidic 장치의 일으키는 인레츠에 삽입 후 주사기 펌프에 연결되어 있습니다.
- 플루오레신 isothiocyanate (FITC) - dextran (MW = 10kD, 10 μm의, 시그마)와 버퍼 (PBS, Invitrogen, CA) 유체 장치 내부의 안정적인 그라디언트를 확인 microfluidic 장치에 들어갈 수 있습니다.
- 세포외 매트릭스 (ECM) (즉, fibronectin)는 인큐베이터에서 1 시간 (37 ° C)에 대한 microfluidic 장치 내부에 코팅됩니다.
- NIH 3T3 fibroblast 세포는 trypsinized 및 dissociated 있습니다.
- Dissociated 세포 2의 세포 밀도 × 10 6 세포 / ML에서 microfluidic 장치 (800 μm의 폭)에로드됩니다.
- 2 ML 미디어 50 NG / ML 표피 성장 인자 (EGF)는 주사기 펌프 (0.05 μl / 분)를 사용하여 가용성 그라디언트 창출을위한 microfluidic 장치로 주입됩니다.
- 전지는 실시간으로 바뀌 현미경 (니콘 TE 2000)를 사용하여 모든 5 분 감시하고 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
세포가 높은 농도쪽으로 마이 그 레이션 microfluidic 장치에서 EGF의 안정적인 농도 기울기에 노출. 셀 마이 그 레이션, chemotactic 지수, 마이 그 레이션하는 세포의 운동성의 방향 방향은 셀 추적 분석에 의해 조사되었다. 따라서,이 그라디언트 생성 microfluidic 플랫폼은 암 전이, embryogenesis, 그리고 축삭지도를 공부하는 데 유용 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | FD10S | Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | human recombinant Epidermal growth factor | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Si wafer | silicone wafer, 4 inch | |||
| Petri dishes | ||||
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectin | ||||
| NIH 3T3 | cell-line | fibroblast cells | ||
| Inverted microscope | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
- Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
- Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
