Summary
Vi beskriver ett protokoll för mikrofabrikationslaboratorier av gradient-genererande mikroflödessystem enhet som kan generera tid och övertoningar i väldefinierade mikromiljö. I detta förhållningssätt kan gradient-genererande mikroflödessystem enheten användas för att studera riktad cell migration, embryogenes, sårläkning och cancer metastaser.
Abstract
Tillverkning och drift av en gradient genererande mikroflödessystem enhet för att studera cellulära beteende beskrivs. En mikroflödessystem plattform är en möjliggörande experimentell verktyg, eftersom det kan exakt manipulera vätska strömmar, möjliggöra hög genomströmning experiment, och genererar stabila lösliga koncentrationsgradienter. Jämfört med konventionella lutning generatorer, poly (dimetylsiloxan) (PDMS)-baserade mikroflödessystem enheter kan generera stabila koncentrationsgradienter av tillväxtfaktorer med väldefinierade profiler. Här utvecklade vi enkel gradient-genererande mikroflödessystem enheter med tre olika vikar. Tre mikrokanaler kombineras till en mikrokanalplatta att generera koncentrationsgradienter. Stabiliteten och formen på gradienter tillväxtfaktor bekräftades av fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran med en molekylvikt liknar epidermal tillväxtfaktor (EGF). Med hjälp av denna mikroflödessystem enhet, visade vi att fibroblaster exponeras för koncentrationsgradienter av EGF migrerat mot högre koncentrationer. Den riktade orientering cell migration och motilitet i migrerar cellerna var kvantitativt bedömts av cellen spårning analys. Således kan denna gradient-genererande mikroflödessystem enheten vara användbart för att studera och analysera beteendet hos vandrande celler.
Protocol
A. mikrofabrikation av gradient-genererande mikroflödessystem enhet
- Den Si wafer behandlas med reaktivt syre plasma (5 min på 30W, Harrick Scientific, NY).
- Negativ fotoresist (SU-8 50, Microchem, MA) är spin-belagd vid 1000 rpm i 1 minut på en Si wafer.
- Skivan är mjuk bakas vid 65 ° C i 10 min och därefter vid 95 ° C i 30 minuter på en värmeplatta.
- Skivan utsätts för UV-ljus (200W) i 3 min genom en öppenhet mask med en minsta karaktäristisk storlek som 30 ìm.
- Skivan är post bakas vid 65 ° C i 1 min och vid 95 ° C i 10 min.
- Si mästare mögel med 100 ìm tjocka kanaler är utvecklat med hjälp av SU-8 fotoresist utvecklare.
- Skivan innehåller mikrokanaler placeras i en Petri-skål.
- Poly (dimetylsiloxan) (PDMS) (Sylgard 184) formar tillverkas genom att blanda silikon elastomer och härdare (10:1 förhållande).
- Den PDMS Blandningen hälls ut på Si mästare mögel.
- SI mästare mögel placeras på en vakuumexsickator att ta bort bubblor i 10 min.
- PDMS är härdad vid 70 ° C under 1 ~ 2 timmar.
- PDMS formar skalas av från Si mästare mögel.
B. experimentuppställning
- Cell inlopp, utlopp, och infusion vikar av PDMS-baserade mikroflödessystem enhet stansas med vassa stämpelur.
- En enhet och en glasskiva (2 × 3 tum) är irreversibelt bundna av reaktivt syre plasma (5 min på 30W, Harrick Scientific, NY).
- Polyeten rör (PE 20, Becton Dickinon, MD) sätts in i infusing vikar av mikroflödessystem enheten och därefter kopplas till en sprutpump.
- Fluorescein (FITC)-dextran (MW = 10kD, 10 mikrometer, Sigma) och buffert (PBS, Invitrogen, CA) är infunderas i mikroflödessystem enheten för att bekräfta stabila gradienter inuti fluidic enheten.
- Extracellulär matrix (ECM) (dvs fibronektin) är belagd inuti mikroflödessystem enheten för 1 timme i kuvös (37 ° C).
- NIH 3T3 fibroblast celler trypsinized och dissocierade.
- Dissocierade celler laddas in i mikroflödessystem enhet (800 ìm bred) på cell-täthet av 2 × 10 6 celler / ml.
- 2 ml media och 50 ng / ml epidermal tillväxtfaktor (EGF) är infunderas i en mikroflödessystem anordning för att generera lösliga övertoningar med hjälp av en sprutpump (0,05 l / min).
- Cellerna i realtid kontrolleras var 5 min med hjälp av ett inverterat mikroskop (Nikon TE 2000).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Celler som utsätts för en stabil koncentrationsgradienter av fonden i en mikroflödessystem enhet migrerade mot högre koncentrationer. Den riktade orientering cell migration, kemotaxi index motilitet migrera celler undersöktes för cell tracking analys. Därför kunde denna gradient-genererande mikroflödessystem plattform vara användbart för att studera cancer metastaser, embryogenes och Axon vägledning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | FD10S | Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | human recombinant Epidermal growth factor | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Si wafer | silicone wafer, 4 inch | |||
| Petri dishes | ||||
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectin | ||||
| NIH 3T3 | cell-line | fibroblast cells | ||
| Inverted microscope | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
- Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
- Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
