Summary
Nós descrevemos um protocolo para a microfabricação do dispositivo de geração de gradiente microfluídicos que pode gerar gradientes espaciais e temporais bem definidos em microambiente. Nesta abordagem, o dispositivo de geração de gradiente microfluídicos pode ser usado para estudar a migração celular dirigido, a embriogênese, cicatrização de feridas, e metástase de câncer.
Abstract
A fabricação e operação de um dispositivo de geração de gradiente microfluídicos para estudar o comportamento celular é descrito. Uma plataforma microfluídica é uma ferramenta que permite experimental, precisamente porque pode manipular fluxos de líquidos, permitem alto rendimento experiências, e gerar gradientes de concentração estável solúvel. Comparado com os geradores gradiente convencional, poli (dimetilsiloxano) (PDMS) com base em dispositivos microfluídicos pode gerar gradientes de concentração de fatores de crescimento estável, com perfis bem definidos. Aqui, nós desenvolvemos simples gradiente de geração de dispositivos microfluídicos com três entradas distintas. Três microcanais combinados em um microcanal de gerar gradientes de concentração. A estabilidade ea forma de gradientes de fator de crescimento foram confirmados por fluoresceína isothyiocyanate (FITC)-dextran com peso molecular semelhante ao fator de crescimento epidérmico (EGF). Usando este dispositivo micro, foi demonstrado que fibroblastos expostos a gradientes de concentração de EGF migraram para concentrações mais elevadas. A orientação direcional de migração celular e motilidade das células migrando foram quantitativamente avaliados por análise de células de rastreamento. Assim, este dispositivo de geração de gradiente microfluídicos pode ser útil para estudar e analisar o comportamento das células migratórias.
Protocol
A. Microfabricação do dispositivo de geração de gradiente microfluídicos
- O wafer Si é tratada com plasma de oxigênio reativo (5 min de 30W, Harrick Científico, NY).
- Fotorresiste negativo (SU-8 50, Microchem, MA) é spin-revestido a 1000 rpm por 1 min em um wafer de silício.
- O wafer é mole cozido a 65 ° C por 10 min e, posteriormente, a 95 ° C por 30 min em uma placa.
- O wafer é exposto à luz UV (200W) por 3 minutos através de uma máscara de transparência com uma dimensão mínima de 30 mm.
- O wafer é pós cozido a 65 ° C por 1 min e em 95 ° C por 10 min.
- Si molde mestre com 100 canais mm de espessura é desenvolvido usando SU-8 desenvolvedor fotorresiste.
- O wafer contendo microcanais é colocado em um prato de Petri.
- Moldes de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) (Sylgard 184) são fabricados pela mistura de elastômero de silicone e um agente de cura (10:1).
- A mistura PDMS é derramado no molde mestre Si.
- O molde mestre Si é colocada em um dessecador de vácuo para remover as bolhas por 10 min.
- PDMS é curado a 70 ° C por 1 ~ 2 horas.
- Moldes PDMS são descascadas do molde mestre Si.
B. configuração Experimental
- Entrada de celulares, de saída, e infundindo entradas do dispositivo PDMS baseado microfluídicos são perfurados utilizando perfuradores afiados.
- Um dispositivo e uma lâmina de vidro (2 × 3 polegadas) estão irreversivelmente ligados pelo plasma reativas de oxigênio (5 min de 30W, Harrick Científico, NY).
- Tubos de polietileno (PE 20, Becton Dickinon, MD) é inserido na infundindo entradas do dispositivo micro e posteriormente ligado a uma bomba de seringa.
- Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextran (MW = 10kD, 10 mM, Sigma) e buffer (PBS, Invitrogen, CA) são infundidas no dispositivo microfluídicos para confirmar gradientes estáveis dentro do dispositivo fluídico.
- Matriz extracelular (ECM) (ie, fibronectina) é revestido no interior do dispositivo micro por 1 hora em incubadora (37 ° C).
- Células de fibroblastos NIH 3T3 são tripsinizados e dissociado.
- Células dissociadas são carregados para o dispositivo micro (800 m de largura) na densidade de células de 2 × 10 6 células / ml.
- 2 media ml e 50 ng / ml do fator de crescimento epidérmico (EGF) é infundida em um dispositivo micro para gerar gradientes solúveis utilizando uma bomba de seringa (0,05 mL / min).
- Células são monitorados em tempo real a cada 5 minutos usando um microscópio invertido (Nikon TE 2000).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Células expostas a gradientes de concentração estável de EGF em um dispositivo micro migraram para concentrações mais elevadas. A orientação direcional de migração celular, índice quimiotático, motilidade das células migrando foram investigadas pela análise de células de rastreamento. Portanto, esta plataforma de geração de gradiente microfluídicos poderia ser útil para estudar metástase de câncer, a embriogênese, e orientação axônio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | FD10S | Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | human recombinant Epidermal growth factor | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Si wafer | silicone wafer, 4 inch | |||
| Petri dishes | ||||
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectin | ||||
| NIH 3T3 | cell-line | fibroblast cells | ||
| Inverted microscope | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
- Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
- Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
