Summary
В этом докладе, мы демонстрируем системы, чтобы изолировать и культуры донорских клеток от мышей молочной железы, и orthotopically трансплантации этих клеток мышам-получателей, чтобы проанализировать стромальных: эпителиальных взаимодействий в молочных развития опухоли.
Abstract
Влиянием стромальных клеток, включая фибробласты на молочные прогрессии опухоли были хорошо документированы с помощью мыши моделей, в частности, путем трансплантации стромальных клеток и клеток эпителия молочной железы мышей. Современные модели трансплантации часто связаны с использованием иммунитетом мышей из-за различных генетических особенностей, характерных для клетки стромы и эпителиальных клеток. Внеклеточной матрицы часто используется для внедрения двух различных типов клеток для последовательного межклеточных взаимодействий, но связаны с использованием Матригель или крысы хвост коллагена, которые иммуногенных субстратов. Отсутствие функциональной Т-клеток от мышей иммунитетом предотвращает точную оценку стромальных клеток опухоли молочной железы на прогрессию в живом организме, что имеет важные последствия на развитие и эффективность лекарств. Более того, ослабленным иммунитетом мышей являются дорогостоящими, трудно породы и требуют особых условий ухода. Чтобы преодолеть эти препятствия, мы разработали подход к orthotopically трансплантации стромальных клеток и эпителиальных клеток мышам с того же генетического фона, чтобы вызвать последовательное формирование опухоли. Эта система включает в себя уборка нормальная, рак связаны фибробластов, PyVmT клетки молочной железы рак и коллаген-доноров мышам C57BL/6J. Затем клетки встроенных в коллагене и пересадить в паховых молочных желез самок мышей C57BL/6J. Трансплантация PyVmT клетки только форма ощутимой опухоли 30-40 дней после пересадки. Endpoint анализ на 60 дней показывает, что совместное трансплантации фибробластов усиливает рост опухоли молочной сравнению с PyVmT клетки трансплантировали в одиночку. Хотя клетки и матрицы от мышей C57BL/6J были использованы в этих исследованиях, изоляции клеток и матричных и трансплантации подход может быть применен к мышей от различных генетических фоны демонстрируя универсальность. Таким образом, эта система может быть использована для исследования молекулярных взаимодействий между клетками стромы и эпителиальных клеток, и преодолевает ограничения критических с ослабленным иммунитетом модели мыши.
Protocol
1. Выделение и извлечение доноров коллагена от мышей C57BL/6J
- Жертва зрелых нормальных самок мышей C57BL/6J с использованием утвержденных IACUC методами.
- Урожай хвосты и замочить в 70% этаноле в течение 45 минут для стерилизации тканей. Сухие хвосты с папиросную бумагу, завернуть в алюминиевую фольгу. Магазин хвосты от -20 ° C до необходимости.
- Место хвосты в стерильной среде, таких как капот ламинарного потока. Использование ножницы, сплит кожу корня хвоста и очистить от хвоста. Удалить 0,5 до 1 см с обоих концов хвост и разделить оставшиеся хвост на три или четыре части. Рассекают сухожилия с хвостами и отдельные сухожилия на отдельные волокна с помощью скальпеля или лезвия бритвы.
- Передача сухожилия волокон стерильный контейнер и промыть стерильной дистиллированной водой. Трансфер из сухожилий хвоста 5-7 мышей 50 мл коническую трубку с 35 мл стерильной деионизированной воды, содержащей 50 ед / мл пенициллина пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина и 250 нг / мл амфотерицина, и 0,034 N разбавленной уксусной кислотой из маточный раствор ледяной уксусной кислоты (17 N). Место на рокера при 4 ° С в течение недели, чтобы извлечь коллаген.
- Спином вниз мусора в столешнице центрифуге при 3000 г в течение 15 минут. Передача супернатант, примерно 30 мл до двух поликарбонатные трубы адаптированы для Бекман 50,2 Ti ротора и спина в 35000 г (примерно 17000 оборотов в минуту) в течение 1 часа.
- Объем супернатанта должна быть уменьшена до достижения концентрации 1-2 мг / мл. Передача супернатант к ultracel 50 к Amicon блок фильтрации и спина в столешнице центрифуге при 3000 оборотов в минуту в течение 15 при 4 ° C. Передача фильтрата стерильные конические трубки и сохранить. Повторите центрифугирования пока объем уменьшается до 5-6 мл.
- Прочитано концентрации белка. Мы используем стандартные Бредфорда (Biorad), используя стандарты BSA (Biorad) и неразбавленный образцов. Мера выборки из вашего фильтрата, в качестве отрицательного контроля.
- Дальнейшая проверка чистоты добычи путем разрешения образца очищенного коллагена на 6% SDS полиакриламидном геле, 10 переулков, 1,5 мм толщины геля. Подготовка 20 мкг образца в 30 мкл 1x SDS-PAGE загрузки буфера, содержащего 63 мМ Трис-HCl 10% глицерина, 2% SDS 0,0025% бромфенолового синего в 1,5 мл пробирок Эппендорф. Подготовка эквивалентное количество белка из крысиного хвоста коллагена типа I в качестве положительного контроля. Кроме того, подготовить набор стандартов BSA в 2,5, 5, 10, 20 мкг разводят в PBS и 1X загрузки буфера. Отварите образцов при 95 ° С в течение 5 минут.
- Пусть образцы прохладно и кратко микроцентрифужную (максимальная скорость в течение 10 секунд) для замедления вращения конденсации.
- Загрузите образцы образцы наряду с маркер молекулярного веса. Например, нагрузка 5 мкл Калейдоскоп стандартных белков Biorad. Electrophorese при 150 вольт в течение приблизительно 1 часа или пока краска фронт достигнет дна.
- Удаление геля и пятна в буфере Кумасси синий. Подготовка этого буфера путем смешивания 2 г Кумасси синий, 75 мл ледяной уксусной кислоты, 500 мл этанола в общем объеме 1000 мл, содержащих де-ионизированной воды. Также приготовьте такое же количество destain буфера, используя рецепт только без реагента Кумасси синий. Обложка гель с достаточным объемом для Кумасси синий и место на рокера.
- Рок мягко в течение 1 часа при комнатной температуре и переливать пятно. Замените destain решение, когда оно становится темно-синим. Задержать гель на ночь или до отдельных полос решаются на геле. Найдите два коллагена полос (молекулярный вес = 90 кДа и 130 кДа) и обратите внимание на прочность полос от стандартов и контроля. Изображение геля с помощью системы гель документ, в случае необходимости.
2. Выделение и культуры донорских клеток молочной железы рак и фибробласты из нормальной и PyVmT мышей C57BL/6J
- Жертва соответствующей возрастной женщины нормальным или PyVmT трансгенных мышей после 10-недельного возраста, когда опухоли являются очевидными и ощутимыми в PyVmT трансгенных мышей с использованием утвержденных IACUC методами.
- Expose мыши на спине на плоской поверхности и иммобилизации конечностей использования клейкой ленты.
- Сделать с ног на голову T разрез между соски грудной и паховых молочных желез и тянуть обратно кожный лоскут, чтобы разоблачить молочных желез. Удаление молочных тканей и фарш на небольшие части, используя хирургические ножницы.
- Подготовка 100 мл ферментативного переваривания коктейль, содержащий: 200 мг трипсин, коллагеназа 500 мг, 4 мг ДНКазы, 100000 единиц гиалуронидазы в стерильном PBS и антибиотиками всю ночь на льду, а затем в течение 3 часов при температуре 37 ° C.
- Добавьте 10 мл PBS, содержащего 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) для каждого образца и центрифуги осадок клеток в столешнице центрифуге при 1500 оборотов в минуту в течение 5 минут при 4 ° C.
- Аккуратно аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 5-7 мл PBS/10% FBS. Повторите спина и мыть два раза.
- Ресуспендируют осадок клеток в 10 мл DMEM, содержащей 10% FBS, содержащий 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина и 250 нг / мл амфотерицина на 10 см блюда покрыта коллагена типа I. Для пальто пластин с коллагеном, развести коллагена 1 мл (с использованием фондовых 1,5 мг / мл) на 39 мл 0,02 N уксусной кислоты растворяют в стерильной дистиллированной воде или PBS. Внесите 5 мл коллагена рабочего раствора на 10 см пластин. Инкубируйте при комнатной температуре в течение минимум 10 минут. Аспирируйте избыточного коллагена. Парафильмом неиспользованных плит и хранить при 4 ° С в течение недели.
- Изменение СМИ 2 - 3 раза в неделю. Успешное усвоение тканями будет характеризоваться наличием эпителиальных очагов окружении веретенообразную форму фибробластов клеток.
- Отдельные фибробласты и эпителиальные клетки селективным tryspinization. Аспирируйте СМИ и промыть клетки с PBS один раз. Внесите 1 мл 0,25% trypsin/0.54 мМ ЭДТА на клетки и инкубировать при комнатной температуре. Фибробласты более свободно, чем приверженец эпителиальных клеток. Проверьте фибробластов отряд под микроскопом в течение 2 минут, клетки должны быть плавающие в суспензии или окружены в то время как эпителиальные очагов все равно должны быть привязаны к поверхности.
- Слегка нажмите на блюдо, чтобы ослабить фибробластов и осторожно пипеткой 10 мл сыворотки, содержащей среды в блюдо, чтобы удалить фибробластов.
- Внесите средах, содержащих фибробласты в 15 мл коническую трубку и центрифуги, как описано в шаге 5). Replate этих клеток на коллаген покрытием 10 блюд см и повторить процесс отбора трипсинизации до фибробласты и эпителиальные клетки полностью разделены.
- Проверьте чистоту ячейки с помощью иммунофлуоресценции окрашивание на эпителиальные маркеры, такие как CK14 и CK18 и фибробластов маркеров, таких как альфа-актин гладких мышц (α-SMA).
3. Иммунофлуоресценции окрашивания культивируемых клеток
- Место стекла покровные в 6 см блюд. Стерилизовать ультрафиолетового облучения от 5 до 10 минут в ламинарном боксе.
- Пальто покровное с 1-2 мл рабочего раствора фондовом коллагена в течение 10 минут при комнатной температуре (RT). Аспирируйте избытке.
- Trypsinize и пластины 200000 эпителиальных клеток или фибробластов на образец. Добавить 3-5 мл полной среды и инкубировать в течение 24 часов.
- Аспирируйте СМИ, мыть клетки с PBS и исправить в ледяной метанола при температуре -20 ° С в течение 7 минут.
- Вымойте клеток с PBS в два раза, чтобы удалить этанол, и блок с 1-2 мл PBS, содержащего 1% FBS в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Использование щипцов, удалите покровные и место в большой мелкий контейнер покрытый парафильмом или другой поверхности гидрофобной.
- Развести следующих первичных антител 1:100 в блокировании решения: анти-актин гладких мышц (α-SMA, анти-CK14 (базальной эпителиальной маркер), анти-CK18 (просвета эпителиальных маркеров).
- Внесите 100 мкл антител непосредственно на покровных в течение 1 часа при комнатной температуре. Инкубируйте отдельных покровное клеток в блокировании решения; этот пример будет служить в качестве вторичного контроля антител.
- Аспирируйте антител и пипетки 1 мл PBS прямо на покровное мыть. Аспирацию и повторите 3-5 раз.
- Развести следующие вторичные антитела в блокировании решения: анти-мышь-Alexa 488 в 1:100, антимышиным биотинилированного на 1: 500, анти-мышь-Alexa-568.
- Заверните контейнер с покровных в алюминиевую фольгу. Внесите 100 мкл соответствующего вторичного антитела непосредственно на покровные: α-SMA с анти-мышь-Alexa 568, CK 14 окрашивания антимышиным биотинилированного и CK18 с анти-мышь-Alexa 488. Крышка контейнера для защиты образца от видимого света.
- Аспирируйте антител и промыть PBS, как в пункте 9). Оставьте образцов в PBS, за исключением CK14 окрашивания.
- Развести стрептавидин конъюгированные с Alexa 568 1:500 в PBS. Инкубируйте CK14 окрашенных образцов с strepatividin-Alexa 568 в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Стирать в PBS, как в пункте 9)
- Развести DAPI 1: 500 в PBS. Аспирируйте PBS из образцов и инкубировать с DAPI в течение 10 минут РТ в темноте.
- Промыть образцов с PBS. Внесите 100 мкл Продли анти-Fade реагента на стеклах, повернуть покровное над тем, что клетки, стоящие перед стекло. Tilt покровное к одним углом, чтобы аккуратно установить контакт с монтажа средств массовой информации.
- Изображение образцов с использованием иммунофлюоресценции микроскопом. Храните образцы в темноте, чтобы защитить иммунофлюоресценции сигнал, который продлится около 2 недель.
4. Подготовка коллагена встроенных клетки для пересадки
- Чтобы внедрить в клетки коллагена, необходимо снизить рН коллагена для достижения полимеризации путем смешивания коллагена с настройки решения. Подготовка настройка решения путем смешивания 100 мл сбалансированного солевого раствора 10X Графа (EBSS) с 2,45 г NaHCO3, 7,5 мл 1 М NaOH и 42,5 мл стерильной дистиллированной воды. Далее стерилизовать используя бутылку верхней 0,22 микрон фильтр прилагается к стерильной бутылке. <LI> Mix коллагена (фондовый концентрации 1 мг / мл) с установкой решение по стартовой 4: 1 отношение. С одной стороны трансплантата, смешать 100 мкл коллагена с 25 мкл установка решения в трубке Эппендорф. Кратко Vortex или пипеткой образец вверх и вниз, перемешать образец тщательно.
- Добавить коллагена или установки решения на 5-10 мкл шагом и тщательно перемешать до фенола красного красителя в смеси изменений в светло-розового до оранжевого цвета, отражающие нейтральным рН. Желтый цвет указывает на кислую рН в то время как темно-розовый, отражает основные рН. Держите смесь на лед, чтобы предотвратить полимеризацию.
- Удалить фибробласты и эпителиальные клетки пластины трипсинизации. Во-первых, аспирация СМИ и промыть 5 мл PBS. Внесите 1 мл 0,25% trypsin/0.54 мМ ЭДТА в HBSS на чашку. Инкубируйте фибробластов при комнатной температуре в течение 2-5 минут. Инкубируйте эпителиальных клеток при 37 ° С в течение 2-6 минут. Нажмите пластин осторожно, чтобы ослабить клеток. Проверьте отряд использованием microscope.Quench трипсина с помощью пипетки 9 мл полной среды на тарелку и передачи клеткам стерильные 15 мл коническую трубку.
- Удалить 50 мкл и считать клеток гемоцитометра. Обратите внимание, общий объем клеток в каждую пробирку (примерно 10 мл).
- Гранул клеток при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте осадок клеток и ресуспендируйте клетки концентрация 100000 cells/100 мкл. Например, ресуспендируют 500000 клеток в общем объеме 500 мкл полной информации.
- Смешать 250 000 стромальных клеток (250 мкл) и 100000 опухолевых клеток (100 мкл) в отдельном трубки. Микроцентрифужную 10 с 1000 оборотов в минуту, удалить супернатант с помощью пипетки. Добавить 50 мкл регулируется решением коллагена в клетках. Внесите вверх и вниз, чтобы разогнать клетки равномерно. Внесите 50 мкл в стерильные 6 см планшета для культуры ткани образуют круговой капли. Инкубируйте трансплантата при 37 ° С в течение 10 минут к полимеризации.
- Аккуратно добавить 5 мл полной среды в пластине за счет наклона пластины под углом и медленно пипетирования СМИ одной стороне пластины. Наклон пластины вокруг, пока СМИ освещают трансплантата.
- Инкубируйте в течение 24 часов при температуре 37 ° C. Пересадка сразу.
5. Ортоптическое трансплантации коллагена встроенных клеток у мышей C57BL/6J
- Изготовление тонкой стеклянной палочки для трансплантационной хирургии. Тепло пипетки Пастера стекла использованием горелки Бунзена. Использование щипцов, стрейч конца пипетки из до 2-3 мм в толщину. Дайте остыть, и стерилизовать на 70% этанола.
- Стерилизовать следующие хирургические инструменты в автоклаве и 70% этилового спирта: изобразительное хирургических ножниц, тупая хирургические ножницы, пинцеты тупой, тонкие щипцы, раны клипы, раны основных
- Анестезию мыши, используя с 2-3% изофлуран использованием изофлуран очистки машины. Средний O 2 скорость потока используется 1 л / мин через носовой обтекатель.
- Положите мыши на его спине и иммобилизации конечностей с лентой или другой съемный клей. Удалить волосы с химической удаления волос, таких как Наир. Стерилизовать живота с хлопком моечные альтернативно от 70% этанола и бетадин в целевой подобным же образом.
- Держитесь части кожи молочной железы использованием тупых щипцы с одной стороны. С другой стороны, используя тупые ножницы хирургические, чтобы с ног на голову Т-разрез между # 9 и # 10 сосков или # 4 и # 5 соски паховых молочных желез подвергать молочных желез.
- Сделать карманные разрез под лимфатических узлов или молочных артерии с небольшими хирургическими ножницами весной.
- Удалить из коллагена трансплантата блюдо культуры тканей использованием щипцов. Удалите излишки жидкости из коллагена трансплантата, аккуратно вытирая на стерильной вытереть и слайд коллагена трансплантат полностью в карман с помощью тонкой стеклянной палочки.
- Шовный кожный лоскут с помощью # 2 кишки рассасывающиеся нити или рана скоб.
- Пусть мыши восстанавливаться в клетке.
- Монитор мыши два раза в неделю, как минимум, для пальпации опухолей. Жертва мышей, когда опухоль достигает 1 см в диаметре. Урожай тканей для анализа.
6. Представитель Результаты:
Выделение и извлечение коллагена от мышей C57BL/6J
Эти процедуры были адаптированы из 1. Добыча белка коллагена от 5-7 хвостов мышей дает примерно 1-1,5 мг / мл в 6 мл конечного объема, или 6 - 9 мг белка. По coommassie пятна, полосы, соответствующие 90 кДа и 130 кДа обнаружены в переулках загружены образцы, извлеченные из хвостов мышей, что указывает на наличие коллагена типа I и про-коллагеновые соответственно (рис. 1).
Выделение и культуры клеток молочной железы рак и фибробласты из нормальной и PyVmT мышей C57BL/6J.
Процедуры были адаптированы из 2. PyVmT карциномы клеток и фибробластов можно выделить различия в морфологии клеток и экспрессии специфических эпителиальных и мезенхимальных рынковKERS. Клетки карциномы PyVmT идентифицируются по форме булыжника и со-экспресс CK18, просвета эпителиальных маркеров и CK14, базальной эпителиальной маркер, но не выразить α-SMA (рис. 2). Молочные фибробласты больше клеток с фенотипом веретенообразную форму и выразить высокие уровни α-SMA, но не выражают CK14 или CK 18 (рис. 2). Эти данные свидетельствуют о более чем 95% чистоты ячейки для фибробластов и эпителиальных клеток с использованием изложенных процедур.
Ортоптическое трансплантации коллагена встроенных клеток у мышей C57BL/6J
Эти процедуры были адаптированы из 3, 4. Трансплантация получателя мышей приносятся в жертву, когда опухоли в любой экспериментальной группы достигают 1,0 см в диаметре, или примерно 60 дней. Хотя трансплантация PyVmT клетки только приводит к ощутимой опухоли после 30 - 40 дней, достигая средней опухоли массой 0,335 грамма на 60 дней, со-трансплантация PyVmT клетки карциномы молочной с результатами фибробластов в средней опухоли массой 0,630 грамма, что указывает на повышение опухолевого роста фибробластов (рис. 3).
Рисунок 1. Кумасси пятно анализ коллагена типа I извлечения из мышь хвосты. BSA (~ 66 кДа) отмечен стрелкой. Коммерческая коллагена хвоста крысы (20 мкг белка), и очищенный коллаген мышь хвоста (20 мкг белка) обозначены поле (~ 130 кДа, ~ 90 кДа белков). Std = молекулярная стандартного веса.
Рисунок 2. Иммунофлуоресценции окрашивание доноров PyVmT клетки молочной железы рак и фибробластов. Панели и б представляют PyVmT клетки молочной железы рак immunostained на наличие антител к CK14 и CK18. Группа с представляет фибробластов окрашивали антителами к α-SMA. Изображения отображаются с DAPI наложения на 20-кратным увеличением.
Рисунок 3. Молочные развития опухоли у мышей C57BL/6J в наличии или отсутствии фибробластов. Опухолей молочной железы были собраны от мышей, пересаженных с клетками карциномы PyVmT в наличии или отсутствии молочных фибробластов и взвешивали. Средний + стандартная ошибка среднего. N = 6 в группе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Функциональный вклад фибробластов в опухолевой прогрессии была продемонстрирована на основе моделей трансплантации, в которых рак связаны фибробластов совместно с пересаженной доброкачественные эпителиальные клетки результатов в увеличении роста опухоли и инвазивности 5. Традиционные подходы трансплантации связаны с использованием SCID или голым мышам к сотрудничеству трансплантации стромальных и эпителиальных клеток из различных генетических фоны мыши или разных видов. Иммунодефицитом мышей отсутствие функциональных Т-клеток, которые играют решающую роль в посредничестве противоопухолевого иммунитета путем признания специфических антигенов опухоли и последующие нападения на опухолевые клетки, препятствуя распространению метастазов 6. Кроме того, недавние исследования показали, что фибробласты являются важными регуляторами иммунного набора ячейки 7, 8, о том, что разработка новых подходов к изучению стромальных: эпителиальных взаимодействий клетка необходимы для того, чтобы более четко понять механизмы молочных прогрессии опухоли. Изложены процедуры демонстрируют надежный способ: выделить и культуры молочной эпителиальных и мезенхимальных клеток и orthotopically трансплантации этих клеток в иммунокомпетентных мышей формы опухолей молочной железы. Использование изложенных процедур, мы привиты более 40 мышей с использованием различных экспериментальных групп и разные конечные точки с более чем 97% успешной трансплантации скорости, демонстрируя надежность этой системы. Эффекты молочных фибробластов на рост опухоли в этой системе в соответствии с ранее опубликованных исследований с участием subrenal капсулы пересадки фибробластов с клетки молочной железы рак 9. Мы нашли несколько проблем с системой, в настоящем докладе. Если концентрация в результате акции слишком мала для встраивания клетки, можно сконцентрировать дальнейшие коллагена для уменьшения громкости или изолировать больше коллагена из дополнительных хвосты. Чтобы обеспечить последовательное формирование опухоли, важно, чтобы разогнать клетки равномерно в течение коллагена плагин коллагена с помощью пипетки и избегать наличие пузырьков в коллагеновой пробки.
Низкий фон образования опухоли в C57BL/6J мышей 10, 11 позволяет исследовать функциональное вклад конкретных онкогенов или инактивации опухолевых супрессоров в стромальных: эпителиальных взаимодействий в молочных прогрессии опухоли. Выражение конкретных онкогенов и опухолевых супрессоров может быть изменен в стромальных клеток или эпителиальных клеток посредством стабильного выражение siRNAs например, перед трансплантацией. Потому что первичные клетки стареть с постоянным пассажи, генетические манипуляции культивируемых клеток легче, если клетки увековечен, например, путем спонтанного увековечение или выражение онкоген 12, 13, 14, 15. Увековечению различных типов клеток стромы была достигнута с макрофаги и эндотелиальные клетки, 16, 17, 18. Иммунофлуоресцентного метода для конкретных стромальные и эпителиальные маркеры показали высокой степени очистки популяции фибробластов и эпителиальных клеток, выделенных в этих исследованиях. Тем не менее, выявление загрязняющих клеточные популяции может потребовать использования потока сортировки дальнейшей очистки желаемого клеточных популяций. В качестве альтернативы иммортализации и генетические манипуляции в области культуры, исследователи также выделили специфические типы клеток из трансгенных мышей через поток сортировки и непосредственно трансплантировали эти клетки в мышей для изучения различных тканей, в том числе молочной железы 19, 20. Такой подход Этот подход дает физиологически соответствующих первичных элементов, но требует изоляции клеток мышей каждый раз. Тем не менее, поставки клеток и чистоты популяции клеток, которые зависят от обилия типа клеток и количество мышей доступны. Эти проблемы могут быть преодолены при трансплантации опухолевых клеток у мышей проведения флуоресцентной репортер, таких как актин-GFP мышей 21. В этой системе, можно было бы быть в состоянии исследовать влияние стромы на общую опухолевой прогрессии, но не выделить вклад конкретных стромальных клеток. Каждый из подходов, приходит с конкретными преимуществами и недостатками, и может быть объединена с системой, описанных в данном докладе, в соответствии с потребностями следователей. Кроме того, описанная система может быть адаптирована или модифицированное для трансплантации в различные генетические фоны, трансплантации различных типов клеток стромы и эпителиальных клеток молочной при различных состояниях злокачественности, чтобы определить, как эти различные переменные влияют стромальных: эпителиальных взаимодействий и последующего прогрессирования опухоли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эксперименты на животных:
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными IACUC комитета при Университете Канзаса медицинский центр.
Acknowledgments
Этот проект был профинансирован через НИЗ / NCI номер гранта R00 CA127357 и Канзасского университета онкологический центр фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6N mice | Harlan Laboratories | N/A | |
| MMTV-PyVmT transgenic mice | Jackson Laboratory | 002374 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3039603PR | |
| DMEM | VWR international | 10000113873 | |
| Penicillin/streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-001 | |
| amphotericin | Fisher Scientific | BP2645-20 | |
| Amicon filtration columns ultracel 50k | EMD Millipore | UFC905008 | |
| Tubes for Beckman TI rotor | Beckman Coulter Inc. | 355618 | |
| Rat tail collagen | Fisher Scientific | CB 40236 | |
| 10x EBSS | Sigma-Aldrich | E7510-100ML | |
| Trypsin 1X, 0.25% in HBSS w/o Calcium and Magnesium | Fisher Scientific | MT-25-050-CI | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A491-212 | |
| Coomasie blue | Fisher Scientific | BP101 25 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T3924-100ml | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich | ||
| hyalronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Kaleidoscope Protein standard | Bio-Rad | 1610375 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12545-78 | |
| Glass coverslips | VWR international | 101400-042 | |
| Vimentin antibody S-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-7558 | |
| α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | |
| CK14 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-53253 | |
| CK18 antibody | Abcam | ab668 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Anti-mouse biotinylated | Vector Laboratories | BA9200 | Distributed through Fisher |
| Anti-mouse-alexa-568 | Invitrogen | A10037 | |
| Anti-mouse- alexa-488 | Invitrogen | A11001 | |
| Streptavidin- alexa-488 | Invitrogen | S11226 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| Prolong antifade | Invitrogen | P-36930 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-12 | |
| Fine spring scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| # 5 fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Gut chromic suture | Fisher Scientific | NC9326254 | |
| Glass Pasteur pipet | Fisher Scientific | 22-042-815 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A406P 4 | |
| betadine | Fisher Scientific | NC9386574 | |
| Wound clips | Fisher Scientific | 12032-07 | |
| Wound staple | Fisher Scientific | 12031-07 |
References
- Hayward, S., Haughney, P. C., Rosen, M. A., Greulich, K. M., Weier, H. U., Dahiya, R., Cunha, G. R. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-131 (1998).
- Cunha, G., Hom, Y. K., Young, P., Brody, J. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Ethier, S. P., Ammerman, C. A., Dziubinski, M. L. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Medina, D., Kittrell, F. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
- DeNardo, D. G., Johansson, M., Coussens, L. M. Immune cells as mediators of solid tumor metastasis. Cancer Metastasis. 27, 11-18 (2008).
- Naito, M. Macrophage differentiation and function in health and disease. Pathol Int. 58, 143-155 (2008).
- Firestein, G. S. The T cell cometh: interplay between adaptive immunity and cytokine networks in rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 114, 471-474 (2004).
- Cheng, N., Chytil, A., Shyr, Y., Joly, A., Moses, H. L. Enhanced Hepatocyte Growth Factor Signaling by Type II Transforming Growth Factor-{beta} Receptor Knockout Fibroblasts Promotes Mammary Tumorigenesis. Cancer Res. 67, 4869-4877 (2007).
- Qiu, T. H. Global expression profiling identifies signatures of tumor virulence in MMTV-PyMT-transgenic mice: correlation to human disease. Cancer Res. 64, 5973-5981 (2004).
- Schaffhausen, B. S., Roberts, T. M. Lessons from polyoma middle T antigen on signaling and transformation: A DNA tumor virus contribution to the war on cancer. Virology. 384, 304-316 (2009).
- Cepko, C. L. Immortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction. Annu Rev Neurosci. 12, 47-65 (1989).
- O'Hare, M. J. Conditional immortalization of freshly isolated human mammary fibroblasts and endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 646-651 (2001).
- Shay, J. W., Wright, W. E., Werbin, H. Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization. Biochim Biophys Acta. 1072, 1-7 (1991).
- Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Shen, G. Immortalization of endothelial cells differentiated from mouse embryonic stem cells. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 218-228 (2002).
- Wang, S. J., Greer, P., Auerbach, R. Isolation and propagation of yolk-sac-derived endothelial cells from a hypervascular transgenic mouse expressing a gain-of-function fps/fes proto-oncogene. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32, 292-299 (1996).
- Tiede, B. J., Owens, L. A., Li, F., DeCoste, C., Kang, Y. A novel mouse model for non-invasive single marker tracking of mammary stem cells in vivo reveals stem cell dynamics throughout pregnancy. PLoS One. 4, e8035-e8035 (2009).
- Guzman, R. Intracarotid injection of fluorescence activated cell-sorted CD49d-positive neural stem cells improves targeted cell delivery and behavior after stroke in a mouse stroke model. Stroke. 39, 1300-1306 (2008).
- Duda, D. G. Differential transplantability of tumor-associated stromal cells. Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).
