Summary
Bütün hayvanlar MG53-aracılı hücre zarı tamir ve hücresel seviyede dinamik bir süreç görselleştirmek için kullanılan protokoller burada nitelendirdi. Bu yöntemler, plazma zarı mühürlenirken ve rejeneratif tıp ve hücre biyolojisi araştırmak için uygulanabilir.
Abstract
Hücre zarının akut yaralanma tamir elemental normal hücresel fizyoloji süreci ve hatalı zarı onarımı, pek çok dejeneratif insan hastalıklara bağlı olmuştur. Membran mühürlenirken makine önemli bir bileşeni olarak MG53 son keşfi, moleküler biyoloji, temel doku onarımı yanı sıra, rejeneratif tıp potansiyel translasyonel uygulamaları için daha iyi bir anlayış sağlar. Burada detaylı MG53 in vivo fonksiyonu olarak izole kas liflerinin içine boya giriş ölçerek ex vivo zarı tamir kapasitesini test etmek için fare modelleri, treadmill egzersiz protokolleri kullanarak kas hasarı tamir keşfetmek ve dinamik bir süreç izlenmesi için deneysel protokolleri kültür hücreleri canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak MG53-aracılı vezikül kaçakçılığı ve hücre zarı onarımı.
Protocol
1. Kas Yaralanma kapsamı Fare Modeller Revealing Koşu Koşu Bandı
- Çalışan protokol sırasında kullanmak için koşu bandı yüzey açısı oluşturulması. Genel olarak, düz bir seviye veya 7 ° ve 15 ° derece arasında bir açı yokuş aşağı veya yokuş kullanılır. Bazı koşu bandı, diğerleri koşu bandı başka yollarla yükselebilir ihtiyaç duyarken, eğim ayarlamak için entegre aparatları var.
- Koşu bandı altında çalışan protokol sırasında, hayvanların herhangi bir atık toplamak için koşu bandı, hayvanların koymadan önce bir tepsi ya da mavi bir laboratuar yastık yerleştirin.
- Çalışan fareler, koşu bandı çevre acclimated olmalıdır önce. Bu, elektrik şebekesi ve kayış tahrik motoru ancak kemer (yani 0 m / s hız ile) hareket etmiyor 15 dakika boyunca koşu bandı hayvanlar yerleştirerek içerir.
- Motivasyon elektrikli ızgara üzerinde açın. Kullanılan bakliyat şiddeti ve sıklığı genellikle koşu bandı üzerinde kontrol ama bir üreticiden diğerine değişir. Genellikle, maksimum yoğunluğu ise yüksek frekanslı (en azından her iki saniyede bir kez) uyumu artıracak çalıştırmak için fareler motive etmek için gerekli değildir.
- Çalışan protokol başlamak için koşu bandı kemer etkinleştirin. Bir ilk hızı yaklaşık 5 metre / dk, fareler için bir ısınma dönemi için kullanılmalıdır. Genellikle 1-2 metre / dk her dakika koşu bandı başlangıç aşağıdaki ekleyerek, yavaş koşu bandı hızı hızlandırılabilir.
- Hayvanların çoğu protokollerde Uyum deneysel çalışan başlamadan önce ısınma hızında 3 ila 10 gün boyunca bir dizi kısa çalışır (5 dakika) yaparak geliştirilebilir.
- Akut bir egzersiz yorgunluk genellikle maksimum hıza kadar süre ile koşu bandı hızını artırarak içerecektir (genellikle <30 m / m) farelerin tükenme belirtileri göstermeye kadar elde ve muhafaza edilir. Yorgunluk yargılamak için kriterler değişebilir ancak genellikle bir fare, koşu bandı yüzeye dönmeden, elektrikli ızgara, elektrikli ızgara veya arka arkaya 5 saniye zaman yarıdan daha fazla harcama. Bireysel bir fare bitkin sonra koşu bandı kaldırılabilir ve çalışan toplam süre kaydedilebilir.
- Koşu Bandı açısını değiştirme egzersiz yükü (yokuş yukarı bir açı ile) artırmak veya kas lifleri 1 sarkolemmal zarında yırtılma zarar eksantrik kasılmalar (yokuş aşağı açı ile) ikna etmek için akut çalışan çalışmalarda kullanılabilir. Evans mavi boya, hasarlı kas liflerinin 2,3 tanımlamak için bir histolojik boya olarak kullanmak için bu işlemler öncesinde hayvanların içine enjekte edilebilir .
- Dayanıklılık eğitimi çalışan protokoller zaman uzun bir süre (ay) üzerinden hayvan kas veya kardiyovasküler sistem remodeling üretmek amacıyla bir egzersiz yükü. Isınma prosedürü ancak (> 1 saat) maksimum hızı genellikle düşüktür ve çalışma zamanları oldukça uzun olabilir (adım 1.5), yukarıda belirtilen aynı.
- Farelerin çalışan tamamlanmasından sonra kafeslerine iade edilebilir. Koşu Bantları genellikle fareler çalışırken, özellikle uzun protokoller üzerinden, oldukça kirli. Her kullanımdan sonra, genellikle% 70 etanol sprey, koşu bandı temizlemek için gereklidir.
UV lazer Hasar ardından 2. İzole kas liflerinin Membran Onarım Kapasitesi Ex Vivo Testi
- Fare ayak fleksör digitorum brevis (FDB) kas yüzeysel katmanı parçalara ayır. Birincisi, altındaki kas zarar vermemeye dikkat çekerken, orta hat tek açık cilt kesilir yatay kesimler ve cilt kaldırmak. FDB kas (proksimal tendon) düz beyaz tendon kalkaneus kemik bağlı olarak görülebilir. Pervasızca forseps tendon ayrı ve tendon yakın site eki sever, forseps serbest tendon kapmak ve bağlı kalır herhangi bir bağ dokuları kesim sırasında çevre dokulara FDB ayırmak için hafifçe yukarı çekin. FDB bu tendonların derin kas tabakasına bağlanmak kesim tarafından kaldırılmış olabilir bireysel basamak distal tendon şube görünce.
- FDB kas demeti koyun 1 ml kollajenaz çözüm önceden ısınmış 1,5 ml Eppendorf tüp, tüp yatay yönde 37 ° C orbital çalkalayıcı bir bant içinde 37 ° C ve 200 rpm'de 65 dakika süreyle sallamak. Inkübasyon Times, yıpranmış bir görünüm ve kas soluk renk ile gösterilir yeterli sindirim, sağlamak için ayarlanması gerekir.
- 1 ml pipet ile sindirilir paket kesinti olmadan kolayca geçmesine izin vermek için yeterli bir çapa sahip bir kesim ucu ile 2.5 Ca 2 + Tyrode ~ 600 ul içeren bir 1.5 ul santrifüj tüpü içine sindirilmiş FDB paket dikkatlice aktarın . Paket gevşek liflerin sallamak için tüp yavaşça çevirin.
- 30 mcL pipet Kes böylece dpaket pipet yavaşça içine çekmek ve daha sonra çözüm geri itin pipet kullanın (15 arasında çapı 20 mikron) iameter kas demeti daha sadece biraz daha küçük. Liflerin çoğunluğu paket kopuk olana kadar bu işlemi tekrarlayın.
- Bir cam alt delta T çanak üzerine istenilen miktarda ve bırak kopuk lifleri, tüp hafifçe çevirerek karıştırın. Yük hacmi, izolasyon ve bir tabak belirli bir protokol için gerekli olan faydalı liflerin sayısı verimlilik üzerine göre değişir. Kalan lifleri ° C ek çalışmalar için yaklaşık 6 saat, 4 tüp içinde saklanabilir.
- Çanak, 5 dakika boyunca rahatsız oturmak için izin verin. Bu lifler çanak cam alt yapışmasına yol açar.
- UV lazer ile donatılmış bir konfokal mikroskopi cam dipli çanak yerleştirin. > 100X büyütmede faz mikroskobu altındaki lifler normal bir çizgi çizgi desen ve şekil gibi düz bir çubuk varlığını kontrol etmek için dikkat edin.
- 2.5 mcM 5 final konsantrasyon çözüm FM1-43 veya FM4-64 styrylpyridinium boyalar 4 ekleyin.
- Lif, 45 derecelik bir görüş alanı (Şekil 1) sağ alt sol üst açıyla odaklı fiber konumu görüntüleme penceresinde zarar neden. 5x5 piksel, 5 saniye için maksimum güç (80 mW veya daha fazla, 351 / 364 nm) UV lazer kullanılarak plazma membran bir alan (yaklaşık 0.9μmx0.9μm) ışın tedavisi. Işınlanmış bölge plazma membran bölünmüş; kalan fiber (Şekil 1) dışında olmalı, 5x5 kutusunun yarısı lif içinde olması gerekir,.
- 5 dakika kadar, her biri 5 saniye aralıklarla elyaf haline boya giriş görüntüler yakalayın.
- Floresan boya sonunda elyaf haline endocytosed olacak, çanak başına en fazla 3 elyaflar için adım 2.8 tekrarlayın ve herhangi bir veri analizi zorlaştıracaktır. 3 lifleri adım 2,5 'ten sonra yeni bir yemek hazır olmalıdır.
- Yakalanan her kare arası boya giriş miktarını ölçmek için floresan değişimi (mesafe kadar taşınmış / F 0) hesaplarken verileri analiz ediyoruz. Bu gibi kamuya ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) olarak analiz yazılımı kullanarak 2 bir alanda yaklaşık 200 mikron ortalama floresan ölçüm gerektirir. Lifleri arasında bir karşılaştırma için, her kare için aşağıdaki hesaplama yapılabilir: F 0 ilk yakalanan çerçeve (t = 0; yaralanma önce) ilgi bölgenin ortalama floresan mesafe kadar taşınmış / F 0, ve mesafe kadar taşınmış sonraki her çerçeve floresan değişimi (FF 0).
3. Hücre Zarı Onarım Dinamik Process Monitor Hücre Konfokal Görüntüleme Canlı
- Mikropipetler PYREX kılcal yapılmıştır. Kapiller mikropipet çektirmesi üzerine yerleştirilen ve önceden belirlenmiş bir program (Heat = 695 = 50 çekin; Vel .= 55 gün = 250) tarafından çekildi.
- Mikropipet 3 eksen (xyz) mikromanipülatör bağlanmıştır.
- Hücreler bir cam alt delta T çanak normal yöntemler kullanılarak plazmid DNA ile transfekte. Medya 2.5mm Ca 2 açık olmalıdır + Tyrode tampon önce deneyleri başlar.
- Transfekte hücreler içeren cam yemekleri konfokal mikroskop 40X 1.3NA immersiyon yağı amacı ile bir lazer tarama yerleştirildi.
- Akut canlı hücre hasarı, hücre zarının içine mikropipet ekleyerek yapılır ve sonra hızlı bir şekilde hücre 3,6 mikropipet geri çekmek oldu . 1.54 s / kare bir aralıkta Ardışık canlı hücre görüntüleri elde edildi.
- Saponin indüklenen zarı bozulma testi için, 2.5mm Ca 2% 0.005 'saponin (Sigma) + Tyrode tampon bir ağırlık akış özel monte perfüzyon sistemi 7 ile perfüze edildi. Perfüzyon oranı yaklaşık 1 ml / dak perfüzyon ucu doğrudan görüntülü hücre üstünde olmalıdır.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Fare koşu bandında çalışan bir temsilci, film çekimleri sırasında yapılabilir. Iskelet kas hasarı nedeniyle fare film mg53 / düşük çalışan kapasitesini gösterecektir.
Analiz fiber membran onarım kapasitesi, yukarıda ayrıntılı UV lazer hasar protokolü tarafından yol açtığı hasar ölçüde bağlıdır. Bu kapasite, genotip elyaf izole edilmiş olan fare, ekstrasellüler koşulları ve herhangi bir tadilat protein ekspresyonu (transfeksiyon veya enfeksiyon) tarafından etkilenir. Normal vahşi tip fiber boya girişi (Şekil 2a) hafif ve orta sağlayacaktır. Mg53 / elde edilen kas lifi tehlikeye zarı tamir kapasitesine sahip farelerin fiber (Şekil 2b), boya daha önemli giriş gösterecektir.
Mikroelektrot yaralanma gösterisi translokasyon MG53 içeren vesi için tipik sonuçlaryaralanma sitede CLES. Şekil 3a ve 3b gösterisi GFP-MG53, hücre zarının içine mikropipet ekleme zarar C2C12 myotubes transfekte. GFP-MG53 mikropipet önce hücre hasarı, plazma zarı ve sitoplazma 3 hem de yer almaktadır. Mikropipet penetrasyon sonrasında, GFP-MG53 içeren veziküller zarar siteleri (ok ucu tarafından gösterildiği gibi) doğru ilerledik. Şekil 3c% 0.005 'saponin, plazma zarı permeabilize bir deterjan ile tedavi edilen bir GFP-MG53 transfekte C2C12 matür gösterir. Saponin tedavi üzerine, GFP-MG53 sitoplazmada hücre zarından transloke.
Weisleder, ve ark. Şekil 1. Fiber hizalama ve yaralanma bölge tanımı. Görünümü ve gösterilen yaralanma bölge tanımı alanı içinde izole kas lifi doğru yönlendirmesi.
Weisleder, ve ark. Şekil 2. FDB lif Görüntüler UV lazer hasar önce yaralanma (0 sn, sol) ve 200 sn yazılan yaralanma (sağda) lifler göstermektedir. Vahşi bir tür fare (a) Elyaf hafif yaralanma göstermektedir. Tehlikeye zarı onarımı ile farelerden alınan lifler (b), girmek için boya izin.
Weisleder, ve ark. Şekil 3. Mikroelektrod ve saponin kültür hücreleri zarar verebilir. Görüntüleri C2C12 myotubes (a, b) ve yaralanma (üstte) ve sonrası yaralanma (alt) önce bir C2C12 myoblast (c) göstermektedir. Mikroelektrot (a, b) yaralandı hücreler yaralanma siteleri (oklar) MG53 translokasyon göstermektedir. Saponin (c) ile tedavi edilen hücreler, hücre zarı MG53 translokasyon göstermektedir.
Discussion
Koşu Bandı çalışan tedavi edilen hayvanlar için bir egzersiz yükü sağlayan yararlı bir yöntem. Ölçüm kas fonksiyonu için bir metodoloji ya da dayanıklılık kapasitesi olarak sürekli tekrarlanabilir moda 8 yürütmek zor herkesin bildiği gibi gürültülü bir yaklaşımdır. Genel olarak, yorgunluk kez deney grupları arasında önemli farklılıklar, bazı nakavt fare hatları ve 9 yabani tür fareler arasında bu gibi çözmek için bir bitiş noktası olarak kullanılabilir. Deneysel manipülasyonlar, bazı ilaç denemeleri gibi daha ince fark, üreten, bu tekniği ile ilişkili gürültü üzerinde farklılıkları gidermek olmayabilir. Tekrarlanabilirlik ve duyarlılık bu tekniklerin en üst düzeye çıkarmak için çok yakından oturumunda oturum için gerekli koşulları sağlamak için önemlidir. Gün süre hayvanların yanı sıra kullanılan ısınma dönemi koşulları, icra edildiği önemli faktörlerdir ve deneme yargılanma tutarlı kalmalıdır.
Gerilme etkileri farelerde belirli suşları diğer suşlar daha koşu bandı üzerinde daha fazla zaman aday ve dayanıklılık egzersizi 10 farklı yanıt olarak, koşu bandı protokollerin tasarımı üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir . Genel bir kural olarak, birçok farelerin bir yorgunluk çalışmada toplam 200-300 metre koşu bandı hızı (m / m başladıktan sonra her dakika için 1 ile 5 m / m başlangıç hızı) sabit artış ile çalıştırmak mümkün olacaktır. Bir dayanıklılık egzersizi için fareler 30 dakika 2 ya da 3 haftada bir kere, 9 ila 12 m / m arasında çalıştırmak olabilir. Ancak, bireysel çalışmalar, genellikle, deneysel bireysel ihtiyaçlarına uygun protokol bazı optimizasyon gerektirir.
UV lazer hasar prosedürü, iskelet kas lifleri 3,6,11 zarı tamir kapasitesini ölçmek için etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir . Bu deneylerin başarısı için hayati bir bileşendir izlerse düzenli bir desen ve buruşuk görünmüyor düzgün bir sarcolemma ile düz bir çubuk biçimli bir görünüm ekranı yalnızca kas lifleri kullanmaktır. Diğer kas lifleri seçilirse zarı hasarı Bu deneylerin sonuçları bu lifler ve yorumlama zaten mevcut olabilir komplike olabilir. Işınlanmış bölgenin lif ve tanımı yönünü Şekil 1'de tanımlanmış olması da önemlidir. Bu, böylece lifler arasında karşılaştırma izin tekrarlanabilir büyüklükte bir yaralanma sağlar. Yaralanma tanımlanan bölgenin tamamen fiber içinde yer alıyorsa, bir iç yaralanma sarcolemma kesintiye yerine oluşturulur. Ayrıca, mesafe kadar taşınmış / F 0 için hesaplanan değer faiz ortalama floresan ölçümü için seçilen bölge çok hassastır. Yaklaşık 200μm 2, ve yaralanma sitesi de dahil olmak üzere komşu bir alana uygundur. Yaralanma tanımlanan bölgenin aksine, bu alanda fiber içinde tamamen yalan gerekir. Fiber dış mekan eklerseniz, daha ciddi bir fenotip ile liflerinde mesafe kadar taşınmış / F 0 düşürürken, ortaya çıkan boş bir alanı az boya girişi ile lifleri mesafe kadar taşınmış / F 0 artacaktır . Bu testin duyarlılığı azaltır, böylece lifler arasında karşılaştırma daha zor hale.
Mikropipet hasar tahlil için, etkin bir şekilde hücre zarının zarar için mikropipet ve cam alt çanak arasındaki açı yaklaşık 45 derece olmalıdır. Hücreler, yemeğin altına sıkıca bağlı olmalı ve yuvarlak hücreler mikropipet alay sonra ayırmak, büyük olasılıkla bu yana kullanılan olmamalıdır mikropipet hasar için seçilmiştir. Saponin permeabilzation deneyler, penetrasyon testleri mikropipet ile karşılaştırıldığında daha az gerçekleştirmek için teknik olarak zor ve göreceli olarak daha hızlı. Ancak, saponin hasar saponin diffüz ve o çanak diğer hücrelere zarar verir bu yana sadece bir hücre çanak başına kullanılabilir olması da dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar vardır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | ||
| 70 % ethanol | ISC Bioexpress | ||
| Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 2 mg/ml collagenase type I | Sigma-Aldrich | ||
| 0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| 2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick Scientific | ||
| Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 | |
| LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | ||
| Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| 3 axis micromanipulator | Narishige International | MHW-3 | |
| Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | Bio-Rad | MHW-3 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
References
- Armstrong, R. B., Ogilvie, R. W., Schwane, J. A. Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle. J Appl Physiol. 54, 80-93 (1983).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
- Cai, C. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence. Annu Rev Neurosci. 22, 1-10 (1999).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4592-4597 (2003).
- Cai, C. Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin. J Biol Chem. 284, 15894-15902 (2009).
- Wang, X. Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair. Circ Res. 107, 76-83 (2010).
- Knab, A. M. Repeatability of exercise behaviors in mice. Physiol Behav. 98, 433-440 (2009).
- Zhao, X. Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice. Physiol Genomics. 23, 72-78 (2005).
- Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
- Bansal, D. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
