Summary
Hier beschreven worden protocollen die worden gebruikt om het dynamische proces van MG53-gemedieerde celmembraan te herstellen in zijn geheel dieren en op cellulair niveau te visualiseren. Deze methoden kunnen worden toegepast op de celbiologie van de plasma membraan opnieuw sluiten en regeneratieve geneeskunde te onderzoeken.
Abstract
Reparatie van acute schade aan het celmembraan is een elementair proces van het normale cellulaire fysiologie, en een defecte membraan reparatie is verbonden met een groot aantal degeneratieve ziekten bij de mens. De recente ontdekking van MG53 als een belangrijke component van het membraan opnieuw sluiten machinerie zorgt voor een betere moleculaire begrip van de fundamentele biologie van weefselherstel, alsook voor mogelijke translationeel toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Hier hebben we detail de experimentele protocollen voor het verkennen van de in vivo functie van de MG53 in de reparatie van spierletsel gebruik loopband te oefenen protocollen over muismodellen, voor het testen van de ex vivo membraan reparatie capaciteit door het meten van kleurstof toegang tot geïsoleerde spiervezels, en toezicht op het dynamische proces van de MG53-gemedieerde blaasje mensenhandel en celmembraan reparatie in gekweekte cellen met behulp van live cell confocale microscopie.
Protocol
1. Loopband draaien voor het openbaren van de mate van spierletsel in muismodellen
- Bepaal de hoek van de loopband oppervlak voor gebruik tijdens de lopende protocol. In het algemeen, een vlakke of een hoek tussen 7 ° en 15 ° graden naar beneden of bergop wordt gebruikt. Sommige loopbanden hebben in integrale opstelling op de helling aan te passen, terwijl anderen vereisen de loopband te worden verheven op een andere manier.
- Plaats een lade of een blauwe lab pad onder de loopband voordat de dieren in de loopband om geen afval te verzamelen van de dieren tijdens de lopende protocol.
- Voordat u muizen moeten wennen aan de omgeving van de loopband. Dit houdt in het plaatsen van de dieren in de loopband gedurende 15 minuten met het elektriciteitsnet uit en de riemaandrijving motor op, maar de gordel niet beweegt (dat wil zeggen met de snelheid ingesteld op 0 m / s).
- Zet de motivatie elektriciteitsnet. De intensiteit en de frequentie van de gebruikte pulsen kan meestal worden gecontroleerd op loopbanden, maar varieert van een fabrikant naar de andere. Over het algemeen wordt de maximale intensiteit niet verplicht om muizen te motiveren om te draaien terwijl een hoge frequentie (ten minste eenmaal per twee seconden) zullen beter worden nageleefd.
- Activeer de loopband gordel aan de lopende protocol beginnen. Een eerste snelheid van ongeveer 5 meter / min moet worden gebruikt voor een warm-up periode voor de muizen. De snelheid van de loopband kan langzaam worden versneld, meestal door het toevoegen van 1-2 meter / min voor elke minuut na de start van de loopband.
- Naleving van de dieren in de meeste protocollen kan worden verbeterd door het uitvoeren van een serie van korte (5 minuten) bij warm-up snelheid voor 3 tot 10 dagen voordat de experimentele lopen begint.
- Een acute uitputting oefening zal meestal sprake verhogen van de snelheid van de loopband met de tijd tot aan een maximale snelheid (meestal <30 m / m) wordt bereikt en gehandhaafd tot de muizen vertonen tekenen van uitputting. Criteria voor de beoordeling van uitputting variëren, maar omvatten over het algemeen een muis besteden meer dan de helft van de tijd op het elektriciteitsnet of 5 opeenvolgende seconden op het elektriciteitsnet, zonder terug te keren naar de loopband oppervlak. Na een individuele muis is uitgeput kan worden verwijderd van de loopband en de totale tijd van het runnen van kan worden opgenomen.
- Het veranderen van de hoek van de loopband kan worden gebruikt in acute lopen proeven om de oefening belasting (met een helling hoek) te verhogen of om beschadiging van excentrische contracties (met een downhill hoek) dat de sarcolemmal membranen van de spiervezels een scheur te veroorzaken. Evans blauwe kleurstof kan worden geïnjecteerd in dieren voordat de procedures voor het gebruik als een histologisch kleurstof om beschadigde spiervezels 2,3 identificeren.
- Duurtraining draaien protocollen bieden een oefening belasting van het dier gedurende een langere periode (tot maanden) om herinrichting van de spier of het cardiovasculaire systeem te produceren. Warm-up procedure is hetzelfde als hierboven (stap 1.5) echter de maximale snelheid is over het algemeen lager en de looptijden kan heel lang (> 1 uur).
- Na voltooiing van het uitvoeren van de muizen kunnen worden teruggestuurd naar hun kooien. Loopbanden worden meestal behoorlijk vies, terwijl de muizen lopen, in het bijzonder over lange protocollen. Het is noodzakelijk om de loopband schoon, meestal met een 70% ethanol spray, na elk gebruik.
2. Ex Vivo Assay Membraan Reparatie Capaciteit van geïsoleerde spiervezels Na de UV-laser Damage
- Ontleden van de oppervlakkige laag van de m. flexor digitorum brevis (FDB) spieren van de muis voet. De eerste, snijd de huid van de zool te openen op de mediaan lijn en let niet op de spier schade eronder, maak dan horizontale snijdt en verwijder de huid. De vlakke witte pees van FDB spier (proximale pees) kan worden gezien aan de calcaneus bot. Botweg scheiden de pees door de tang en verbreken de pees dicht bij de plaats van gehechtheid, pak de gratis pees door de tang en trek het zachtjes omhoog om de FDB te scheiden van het omliggende weefsel tijdens het snijden een bindweefsel dat bevestigd blijft. Bij het zien van de distale pezen aftakking naar de afzonderlijke cijfers van de FDB kan worden verwijderd door te snijden waar deze pezen verbinden met de diepere laag van de spier.
- Zet de FDB spier bundel in 1 ml collagenase oplossing voorverwarmd tot 37 ° C in een 1,5 ml Eppendorf buis, tape de buis in een horizontale oriëntatie in een 37 ° C schudapparaat en schud bij 200 omwentelingen per minuut gedurende 65 minuten. Tijden van incubatie kan worden aangepast om voldoende spijsvertering, die wordt aangegeven door een gerafeld uiterlijk en bleke kleur van de spier te verzekeren.
- Breng voorzichtig de verteerd FDB bundelen tot een 1,5 pl centrifugebuis met ~ 600 pl van 2,5 Ca 2 + Tyrode via een 1 ml pipet tip met een afgesneden uiteinde dat een diameter die voldoende is om de verteerde bundel gemakkelijk passeren zonder onderbreking heeft. Voorzichtig flip de buis om de losse vezels van de bundel te schudden.
- Snijd een 30 pi pipettip, zodat de diameter is slechts iets kleiner dan de spier bundel (tussen 15 - 20 urn in diameter) Gebruik de pipet om de bundel zachtjes te trekken in de pipet en vervolgens terug duwen in de oplossing.. Herhaal dit proces tot de meerderheid van de vezels worden gescheiden van de bundel.
- Meng los van elkaar vezels goed door voorzichtig draaien van de buis, neem gewenste hoeveelheid en vallen op een glazen bodem delta T schotel. Het volume om te laden is afhankelijk van de efficiëntie van isolatie en het aantal nuttige vezels die nodig zijn op een schaal voor een bepaald protocol. De overige vezels kan worden opgeslagen in de buis bij 4 ° C gedurende ongeveer 6 uur van bijkomende studies.
- Laat de schaal ongestoord zitten voor 5 minuten. Hierdoor kunnen de vezels zich te houden aan de glazen bodem van de schaal.
- Plaats de glazen bodem schotel op een confocale microscopie is uitgerust met een UV-laser. Let op de vezels onder fase microscopie op> 100X vergroting om te controleren op de aanwezigheid van een normale strepen patroon en een rechte, staaf achtige vorm.
- Voeg FM1-43 of FM4-64 styrylpyridinium kleurstoffen 4 naar oplossing tot een eindconcentratie van 2,5 uM 5.
- Om schade aan de vezel positie in de imaging-venster te induceren, zodat de vezel is gericht op een hoek van 45 ° uit de linker bovenhoek van het gezichtsveld tot op de bodem rechts (figuur 1). Bestralen een 5x5 pixel oppervlakte (ongeveer 0.9μmx0.9μm) van de plasma-membraan met behulp van een UV-laser (80 mW of hoger, 351 / 364 nm), ingesteld op maximaal vermogen gedurende 5 seconden. De bestraalde regio moet splitsen van de plasmamembraan, dat wil zeggen de helft van de 5x5 box moet worden in de vezel, terwijl de rest moet worden buiten de vezel (figuur 1).
- Maak foto's van de kleurstof binnenkomst in de vezel met een interval van 5 seconden tot 5 minuten.
- Herhaal stap 2.8 voor niet meer dan 3 vezels per schotel, zoals de fluorescente kleurstof zal uiteindelijk endocytosed in de vezel en de bemoeilijken alle data-analyse. Na 3 vezels een nieuw gerecht moet worden bereid uit stap 2.5.
- Analyseren van gegevens door het berekenen van de verandering in de fluorescentie-intensiteit (AF / F 0) tussen de vastgelegde frame om de hoeveelheid kleurstof toegang te meten. Dit vereist het meten van de gemiddelde fluorescentie van een gebied van ongeveer 200 micrometer 2 met behulp van analyse software, zoals de openbaar beschikbare ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Voor de vergelijking tussen de vezels, moet de volgende berekening worden gemaakt voor elk frame: AF / F 0, waarbij F 0 de gemiddelde fluorescentie van de regio van belang is in de eerste gevangen frame (t = 0; voor letsel), en de AF is de verandering in de fluorescentie van elke volgende frame (FF 0).
3. Levende cellen Confocale Imaging aan het dynamische proces van celmembraan Repair Monitor
- Micropipetten werden gemaakt van PYREX haarvaten. De capillaire was geplaatst op een micropipet trekker en getrokken door vooraf ingestelde programma (Warmte = 695; Pull = 50; Vel .= 55; Time = 250).
- Micropipet was bevestigd aan een 3-as (xyz) micromanipulator.
- Cellen worden getransfecteerd met plasmide DNA met behulp van normale methoden op een glazen bodem delta T schotel. Media moeten overgezet worden op 2,5 mm Ca 2 + Tyrode buffer voor experimenten te beginnen.
- Glazen schalen die getransfecteerde cellen bevatten werden geplaatst op een laser scanning confocale microscoop met 40x 1.3NA olie-immersie objectief.
- De acute live-celschade werd uitgevoerd door het inbrengen van de micropipet in de celmembraan en vervolgens snel intrekken van de micropipet uit de cel 3,6. Opeenvolgende levende cellen beelden werden verkregen bij een interval van 1,54 s / frame.
- Voor de saponine geïnduceerde membraan verstoring assay, 0,005% saponine (Sigma) in 2,5 mm Ca 2 + Tyrode buffer werd geperfuseerd door een zwaartekracht-flow op maat geassembleerd perfusie systeem 7. De perfusie bedraagt ongeveer 1 ml / min en de perfusie tip moet worden geplaatst direct boven de cel in beeld wordt gebracht.
4. Representatieve resultaten:
Een vertegenwoordiger filmpje van de muis loopband loopt kan worden gemaakt tijdens het filmen. De film zal illustreren de verminderde lopen capaciteit van de mg53-/ - muizen als gevolg van schade aan de skeletspieren.
De omvang van de schade veroorzaakt door de UV-laser schade protocol hierboven beschreven is afhankelijk van het membraan herstelcapaciteit van de geanalyseerde de vezel. Deze capaciteit wordt beïnvloed door het genotype van de muis waarvan de vezel werd geïsoleerd, extracellulaire voorwaarden, en eventuele veranderingen in eiwitexpressie (transfectie of infectie). Een normale wild type vezel zal lichte tot kleurstof entry (Figuur 2a) gemiddeld. Spiervezels afgeleid van de mg53-/ - muizen met een verstoorde membraan reparatie capaciteit weer meer belangrijke toetredingsdrempels van kleurstof in de vezel (Figuur 2b).
Typische resultaten voor micro-elektrode letsel tonen translocatie van MG53-bevattende vesikelen om de schade site. Figuur 3a en 3b tonen GFP-MG53 getransfecteerd C2C12 myotubes beschadigd door het inbrengen van de micropipet in de cel membraan. In de cel voor micropipet schade, is het GFP-MG53 zich op zowel de plasma membraan en cytoplasma 3. Na micropipet penetratie, GFP-MG53 met blaasjes overgeschakeld op schade sites (zoals aangegeven door pijlpunt). Figuur 3c toont een GFP-MG53 getransfecteerd C2C12 myoblasten behandeld met 0,005% van saponine, een wasmiddel dat de plasmamembraan kan permeabilize. Bij saponine behandeling, GFP-MG53 translocatie van cytosol naar de celmembraan.
Weisleder, et al.. Figuur 1. Fiber uitlijning en de schade regio definitie. Juiste oriëntatie van de geïsoleerde spiervezels binnen het gezichtsveld en de definitie van de getoonde letsel regio.
Weisleder, et al.. Figuur 2. UV-laser schade van FDB vezels. Afbeeldingen tonen vezels voorafgaand aan de verwondingen (0 sec, links) en bij 200 sec na de verwonding (rechts). Vezels van een wild-type muis (een) vertonen lichte verwondingen. Vezels van muizen met een verminderde membraan reparatie (b) zodat er meer kleurstof in te voeren.
Weisleder, et al.. Figuur 3. Micro-elektrode en saponine schade aan gekweekte cellen. Afbeeldingen tonen C2C12 myotubes (a, b) en een C2C12 myoblast (c) voorafgaand aan de verwondingen (boven) en na het letsel (onder). Cellen verwond met een micro-elektrode (a, b) tonen MG53 translocatie om letsel sites (pijlen). Cellen behandeld met saponine (c) tonen MG53 translocatie naar de celmembraan.
Discussion
Loopband lopen is een nuttige methodiek op het verstrekken van een oefening belasting van de behandelde dieren. Als een methode voor het meten van spier functie of uithoudingsvermogen is een notoir luidruchtige benadering die is moeilijk uit te voeren in een consistent reproduceerbare wijze 8. In het algemeen kan tijden tot uitputting worden gebruikt als een eindpunt te grote verschillen tussen de experimentele groepen, zoals die tussen een aantal knock-out muis lijnen en wild type muizen 9 op te lossen. Experimentele manipulaties die meer subtiel verschil, zoals sommige farmaceutische processen te produceren, kan niet oplossen van verschillen boven de ruis in verband met deze techniek. Om het maximaliseren van de reproduceerbaarheid en de gevoeligheid van deze technieken is het belangrijk om de voorwaarden voor de sessie tot sessie te houden op de voet. De tijd van de dag de dieren worden uitgeoefend, evenals de warm-up periode gebruikte voorwaarden, zijn belangrijke factoren en consistent te blijven van proef tot proef.
Strain effecten kunnen grote invloed hebben op de vormgeving van loopband protocollen zoals bepaalde stammen van muizen kan voor veel meer tijd lopen op de loopband dan de andere stammen en reageren verschillend op uithoudingsvermogen te oefenen 10. Als algemene richtlijn, zullen veel muizen in staat zijn tot 200-300 meter in totaal een uitputting studie uitgevoerd met een constante verhoging van de snelheid van de loopband (5 m / m initiële snelheid met 1 m / m toegevoegde waarde voor iedere minuut na de start). Voor een uithoudingsvermogen te oefenen de muizen kunnen worden uitgevoerd tussen 9 tot 12 m / m voor 30 minuten twee of drie keer per week. Echter, de individuele studies vereisen doorgaans een optimalisatie van het protocol bij de individuele experimentele behoeften te voldoen.
De UV-laser schade procedure is aangetoond dat het een effectieve methode voor het meten van het membraan reparatie capaciteit van de skeletspieren vezels 3,6,11 worden. Een essentieel onderdeel voor het succes van deze experimenten is het gebruik van alleen spiervezels dat een rechte, staafvormige uiterlijk display met een regelmatig patroon van strepen en een soepele sarcolemma dat niet voorkomt rimpels. Als er andere spiervezels zijn geselecteerd membraan schade kan al aanwezig zijn in deze vezels en interpretatie van de resultaten van deze experimenten kunnen worden gecompliceerd. Het is ook belangrijk dat de oriëntatie van de vezels en de definitie van het bestraalde regio als gedefinieerd in figuur 1. Dit zorgt voor een letsel van reproduceerbare grootte, waardoor vergelijking tussen de vezels. Als het gedefinieerde gebied van letsel ligt volledig binnen de vezel, wordt een inwendig letsel worden gecreëerd in plaats van het verstoren van de sarcolemma. Daarnaast is de berekende waarde voor de AF / F 0 is zeer gevoelig voor de regio van belang geselecteerd voor het meten van de gemiddelde fluorescentie. Een oppervlakte van ongeveer 200μm 2, grenzend aan en met inbegrip van het letsel site geschikt is. In tegenstelling tot de regio gedefinieerd voor letsel, moet dit gebied volledig liggen in de vezel. Als u ook de ruimte buiten de vezel, zal de resulterende leeg gebied te verhogen AF / F 0 in vezels met weinig kleurstof entry terwijl het verlagen van AF / F 0 in vezels met een ernstiger fenotype. Dit vermindert de gevoeligheid van de test, waardoor vergelijking tussen vezels moeilijker.
Voor de micropipet schade test, moet de hoek tussen de micropipet en de glazen bodem schaal ongeveer 45 graden om effectief schade aan de celmembraan. De cellen werden gekozen voor micropipet schade moet stevig worden bevestigd aan de bodem van de schaal en de afgeronde cellen mag niet gebruikt omdat de meeste waarschijnlijk zullen ze los na micropipet porren. Saponin permeabilzation experimenten zijn minder technisch veeleisend en relatief sneller uit te voeren ten opzichte van penetratie testen micropipet. Er zijn echter een aantal beperkingen aan saponine schade, inclusief dat slechts een cel kan worden gebruikt per gerecht, omdat saponine zal verspreiden en andere cellen schade in die schotel.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | ||
| 70 % ethanol | ISC Bioexpress | ||
| Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 2 mg/ml collagenase type I | Sigma-Aldrich | ||
| 0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| 2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick Scientific | ||
| Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 | |
| LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | ||
| Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| 3 axis micromanipulator | Narishige International | MHW-3 | |
| Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | Bio-Rad | MHW-3 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
References
- Armstrong, R. B., Ogilvie, R. W., Schwane, J. A. Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle. J Appl Physiol. 54, 80-93 (1983).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
- Cai, C. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence. Annu Rev Neurosci. 22, 1-10 (1999).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4592-4597 (2003).
- Cai, C. Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin. J Biol Chem. 284, 15894-15902 (2009).
- Wang, X. Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair. Circ Res. 107, 76-83 (2010).
- Knab, A. M. Repeatability of exercise behaviors in mice. Physiol Behav. 98, 433-440 (2009).
- Zhao, X. Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice. Physiol Genomics. 23, 72-78 (2005).
- Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
- Bansal, D. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
