Summary
الموصوفة هنا البروتوكولات المستخدمة لتصور عملية ديناميكية من MG53 بوساطة غشاء الخلية إصلاح في الحيوانات كلها وعلى المستوى الخلوي. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتحقيق في بيولوجيا الخلايا من إعادة عزل غشاء البلازما والطب التجديدي.
Abstract
إصلاح الضرر الحاد إلى غشاء الخلية هي عملية عنصري الفيزيولوجيا الخلوية العادية ، والذي تم ربطه إصلاح خلل الغشاء لكثير من الأمراض التنكسية الإنسان. الاكتشافات الحديثة لMG53 كعنصر أساسي للغشاء آلات إعادة عزل يسمح لفهم أفضل للبيولوجيا الجزيئية الأساسية لإصلاح الأنسجة ، فضلا عن التطبيقات المحتملة متعدية في مجال الطب التجديدي. نحن هنا من التفصيل البروتوكولات التجريبية لاستكشاف في وظائف الجسم الحي من MG53 لاصلاح اصابة في العضلات باستخدام بروتوكولات ممارسة مفرغه على نماذج الماوس ، لاختبار قدرة الغشاء فيفو السابقين إصلاح عن طريق قياس دخول الى صبغ ألياف العضلات المعزولة ، ورصد عملية ديناميكية الاتجار حويصلة MG53 بوساطة إصلاح غشاء الخلية والخلايا المستزرعة في استخدام الخلايا الحية المجهري متحد البؤر.
Protocol
1. مطحنة لتشغيل الكشف عن مدى اصابته في عضلة المجموعات ماوس
- إنشاء زاوية السطح مفرغه لاستخدامها خلال بروتوكول قيد التشغيل. عموما ، وهو مستوى شقة أو زاوية ما بين 7 درجات و 15 DEGREES ° هبوطا أو صعودا يستخدم. بعض المطاحن في الجهاز وضبط جزء لا يتجزأ من الصعود بينما يحتاج البعض الآخر إلى أن تكون مرتفعة في حلقة مفرغة من خلال وسائل أخرى.
- وضع وسادة أو علبة زرقاء المختبر تحت مفرغه قبل وضع الحيوانات في حلقة مفرغة لجمع النفايات من أي حيوان خلال بروتوكول قيد التشغيل.
- وينبغي أن يكون قبل تشغيل تأقلم الفئران لبيئة المطحنه. هذا ينطوي على وضع الحيوانات في حلقة مفرغة لمدة 15 دقيقة مع شبكة الربط الكهربائي وإيقاف المحرك محرك حزام على حزام ولكن لا تتحرك (أي مع سرعة تعيين في 0 م / ث).
- بدوره على الشبكة الكهربائية المحفزة. يمكن عادة كثافة وتواتر النبضات المستخدمة يمكن السيطرة على المطاحن ولكن يختلف من مصنع واحد لآخر. عموما ، لا يلزم لتحفيز أقصى كثافة الفئران لتشغيل بينما تردد عال (على الأقل مرة كل ثانيتين) وتحسين الامتثال.
- تفعيل حزام مفرغه لبدء تشغيل البروتوكول. وينبغي أن تستخدم لسرعة الأولية من حوالي 5 متر / دقيقة لفترة الاحماء للفئران. ويمكن تسريع سرعة مفرغه ببطء ، وعادة بإضافة 1-2 متر / دقيقة عن كل دقيقة بعد بداية حلقة مفرغة.
- ويمكن تحسين الامتثال للحيوانات في معظم البروتوكولات من خلال إجراء سلسلة من المديين القصير (5 دقائق) في سرعة الاحماء لمدة 3 إلى 10 أيام قبل أن يبدأ التشغيل التجريبي.
- تمرين الإرهاق الحاد سوف تنطوي عادة على زيادة سرعة مفرغه مع مرور الوقت حتى السرعة القصوى (عادة <30 م / م) تحقيق والمحافظة عليها حتى الفئران تظهر علامات الإرهاق. معايير للحكم على استنفاد تختلف ولكنها تشمل عموما ماوس انفاق أكثر من نصف الوقت على الشبكة الكهربائية أو 5 ثوان على التوالي على الشبكة الكهربائية من دون العودة إلى السطح مفرغه. ويمكن بعد استنفاد ماوس الفردية يمكن إزالته من مفرغه ويمكن تسجيل الوقت الكلي للتشغيل.
- ويمكن تغيير زاوية مفرغه يمكن استخدامها في تجارب تشغيل الحادة لزيادة ممارسة تحميل (مع زاوية صعودا) أو للحث على انكماش غريب الأطوار الضارة (مع زاوية انحدار أ) التي تمزق الأغشية sarcolemmal من ألياف العضلات 1. يمكن حقن صبغة زرقاء ايفانز في الحيوانات قبل هذه الإجراءات لاستخدامها بوصفها صبغة النسيجي لتحديد الألياف العضلية التالفة 2،3.
- التدريب على التحمل تشغيل بروتوكولات توفير تحميل ممارسة للحيوان على مدى فترة طويلة من الزمن (تصل إلى أشهر) من أجل إنتاج إعادة عرض للعضلات أو نظام القلب والأوعية الدموية. الاحماء الإجراء هو نفسه على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 1.5) إلا أن السرعة القصوى هي بشكل عام أقل وأوقات تشغيل يمكن طويلة جدا (> 1 ساعة).
- ويمكن أن تعاد بعد الانتهاء من تشغيل الفئران لأقفاصها. المطاحن تصبح عادة قذرة للغاية في حين أن الفئران التي تعمل بنظام التشغيل ، ولا سيما عبر بروتوكولات طويلة. فمن الضروري لتنظيف مطحنة ، وعادة مع رذاذ الايثانول 70 ٪ ، وبعد كل استخدام.
2. تحويلة فيفو الفحص القدرة إصلاح غشاء من ألياف العضلات المعزولة في أعقاب الأضرار التي ليزر الأشعة فوق البنفسجية
- تشريح خارج الطبقة السطحية للعضلات المثنية (FDB) القصيرة من سفح الماوس. الأول ، وقطع الجلد من فتح الوحيد في خط الوسط مع الحرص على عدم تلف العضلات تحتها ، ثم جعل التخفيضات الأفقي وإزالة الجلد. ويمكن رؤية وتر العضلة بيضاء مسطحة FDB (وتر الدانية) تعلق على عظم العقبي. بصراحة منفصلة وتر بواسطة ملقط وقطع الوتر الى موقع قريب من المرفق ، والاستيلاء على وتر مجانا بواسطة ملقط واسحبه برفق حتى لفصل FDB من الأنسجة المحيطة بها ، بينما قطع أي الأنسجة الضامة التي لا تزال تعلق. عند رؤية فرع الأوتار البعيدة إلى الأرقام الفردية قد تكون إزالة FDB بقطع هذه الأوتار حيث وصل إلى أعمق طبقة من العضلات.
- وضع حزمة العضلات FDB في 1 مل من محلول كولاجيناز قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية في أنبوب 1.5 مل إيبندورف ، الشريط الأنبوب في اتجاه أفقي في المداري 37 درجة مئوية شاكر ويهز بسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة 65 دقيقة. قد أوقات حضانة يتعين تعديلها لضمان الهضم كافية ، وهو ما أشار إليه مظهر شاحب اللون والمتوترة في العضلات.
- بعناية نقل حزمة FDB هضمها في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ميكرولتر تحتوي ~ 600 ميكرولتر من 2.5 Tyrode + كا 2 عن طريق طرف ماصة 1 مل مع نهاية تقطع تلك التي يبلغ قطرها كافية للسماح لتمرير حزمة هضمها بسهولة من خلال دون انقطاع. الوجه بلطف أنبوب لتهز فضفاض من ألياف الحزمة.
- قطع 30 ميكرولتر ماصة الحافة بحيث دiameter فقط أصغر قليلا من حزمة العضلات (بين 15 -- 20 ميكرون في القطر) استخدم لرسم pipettor برفق في حزمة ماصة ثم دفعها مرة أخرى إلى الحل. كرر هذه العملية حتى الأغلبية من الألياف وفصلها عن حزمة.
- مزيج ألياف نأت بشكل جيد من خلال تحويل بلطف الأنبوب ، يأخذ المبلغ المطلوب وإسقاط على طبق زجاج القاع تي الدلتا. فإن حجم تحميل تختلف على أساس الكفاءة من العزلة وعدد من الألياف المفيدة التي هناك حاجة على طبق لوضع بروتوكول خاص. ويمكن تخزين الألياف المتبقية في الأنبوب عند 4 درجة مئوية لمدة 6 ساعات تقريبا لإجراء دراسات إضافية.
- السماح للطبق على الجلوس دون عائق لمدة 5 دقائق. هذا يسمح للألياف التمسك أسفل الزجاج للطبق.
- وضع صحن زجاج القاع على المجهري مبائر مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. مراقبة الألياف تحت المجهر في مرحلة التكبير> 100X للتحقق من وجود نمط العتابي العادي وعلى التوالي ، ورود مثل الشكل.
- إضافة FM1 - 43 - 64 أو FM4 الأصباغ styrylpyridinium 4 إلى حل نهائي التركيز 2.5 ميكرومتر 5.
- للحث على الأضرار التي لحقت الموقف الألياف في إطار التصوير حتى الألياف موجه بزاوية 45 درجة من الأعلى الأيسر من مجال الرؤية إلى أسفل اليمين (الشكل 1). أشرق منطقة بكسل 5x5 (حوالي 0.9μmx0.9μm) من غشاء البلازما باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية (80 ميغاواط أو أكثر ، 351/364 نانومتر) لتعيين القوة القصوى لمدة 5 ثوان. وينبغي تقسيم المنطقة المشع غشاء البلازما ، أي أن نصف مربع 5x5 ينبغي داخل الألياف ، والباقي يجب أن تكون خارج الألياف (الشكل 1).
- التقاط صور للدخول في صبغ الألياف على فترات كل 5 ثوان لمدة تصل إلى 5 دقائق.
- كرر الخطوة 2.8 لمدة لا تزيد على 3 في صحن الألياف ، كما سيتم في نهاية المطاف أن تكون صبغة الفلورسنت endocytosed في الألياف وتعقيد أي تحليل البيانات. وينبغي بعد 3 ألياف يتم إعداد طبق جديد من الخطوة 2.5.
- تحليل البيانات عن طريق حساب التغير في كثافة مضان (ΔF / F 0) بين كل إطار أسر لقياس كمية من دخول صباغة. وهذا يتطلب قياس مضان متوسط مساحة حوالي 200 ميكرون 2 باستخدام برامج التحليل مثل ImageJ المتاحة علانية (http://rsbweb.nih.gov/ij/). للمقارنة بين الألياف ، ينبغي بذل الحساب التالي لكل الإطار : ΔF / F 0 ، حيث 0 هو F مضان يعني في المنطقة ذات الأهمية في الإطار الأول القبض على (ر = 0 ؛ قبل الإصابة) ، وغير ΔF التغيير في مضان من كل إطار لاحقة (FF 0).
3. خلية حية التصوير متحد البؤر لرصد عملية دينامية للإصلاح غشاء الخلية
- وأدلى Micropipettes من الشعيرات الدموية PYREX. وضعت على شعري مجتذب micropipette وسحبت من قبل برنامج محدد سلفا (الحرارة = 695 ؛ سحب = 50 ؛.= فيل 55 ؛ الزمن = 250).
- وكان يعلق على Micropipette micromanipulator 3 (XYZ) المحور.
- والخلايا التي تحتوي على الحمض النووي transfected البلازميد باستخدام طرق طبيعية على طبق أسفل الزجاج تي الدلتا. وينبغي أن تنتقل إلى وسائل الإعلام 2.5mM كا 2 + Tyrode العازلة قبل بدء التجارب.
- وضعت الأطباق الزجاجية التي تحتوي على خلايا transfected على المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر مع 40X 1.3NA النفط الهدف الغمر.
- تم إجراء الحاد الخلية الحية الضرر عن طريق إدراج micropipette في غشاء الخلية وبسرعة ثم التراجع عن micropipette من أصل 3،6 الخلية. تم الحصول على صور متتالية خلية حية في الفترة الفاصلة من 1،54 ق / الإطار.
- لفحص غشاء سابونين يسببها انقطاع ، سابونين 0.005 ٪ (سيغما) في 2.5mM كا 2 + كان perfused Tyrode العازلة من خلال نظام الجاذبية تدفق نضح مخصصة تجميعها 7. معدل نضح حوالي 1 مل / دقيقة ، وينبغي أن توضع غيض نضح مباشرة فوق الخلية التي يجري تصويرها.
4. ممثل النتائج :
ويمكن إجراء الفيلم ممثل الماوس تشغيل مفرغه أثناء التصوير. الفيلم سوف توضح انخفاض قدرة تسيير mg53 / -- الفئران بسبب الأضرار التي لحقت الهيكل العظمي والعضلات.
مدى الضرر الناجم عن بروتوكول أضرار الأشعة فوق البنفسجية ليزر المفصلة أعلاه يعتمد على قدرة إصلاح غشاء من الألياف تحليلها. وتتأثر هذه القدرة من خلال النمط الوراثي للفأرة الذي كان معزولا من الألياف ، والظروف خارج الخلية ، وأية تعديلات للتعبير البروتين (ترنسفكأيشن أو العدوى). وهناك نوع من الألياف الطبيعية البرية تسمح خفيف إلى معتدل دخول صبغ (الشكل 2A). ألياف العضلات ، المستمدة من / mg53 -- سوف الفئران مع خطر قدرة إصلاح غشاء عرض إدخال أكثر أهمية من الصبغة في الألياف (الشكل 2B).
نتائج نموذجية لإصابة microelectrode إزفاء اظهار MG53 المحتوية vesiالجسيمات في موقع الإصابة. transfected 3A الرقم و3B - MG53 تظهر GFP C2C12 myotubes التي تضررت من micropipette الإدراج في غشاء الخلية. في الخلية قبل micropipette الضرر ، ويقع GFP - MG53 على غشاء البلازما على حد سواء والسيتوبلازم 3. بعد اختراق micropipette ، انتقلت GFP - MG53 الحويصلات التي تحتوي على نحو مواقع الضرر (كما يتبين من رأس السهم). الرقم يدل على 3C - MG53 GFP transfected C2C12 myoblasts تعامل مع 0.005 ٪ من سابونين ، والمنظفات التي يمكن أن permeabilize غشاء البلازما. عند معالجة سابونين ، GFP - MG53 translocated من العصارة الخلوية إلى غشاء الخلية.
يسليدر ، وآخرون. الشكل 1. محاذاة الألياف وإصابة تعريف المنطقة. التوجه السليم للألياف العضلات في عزلة داخل مجال الرؤية وتحديد المنطقة أظهرت إصابة.
يسليدر ، وآخرون. الشكل 2. الأشعة فوق البنفسجية الضرر الليزر صور FDB. تظهر الألياف الألياف قبل الإصابة (0 ثانية ، يسار) وإصابة آخر في 200 ثانية (يمين). ألياف من نوع ماوس البرية (أ) تبين اصابة طفيفة. ألياف من الفئران مع إصلاح غشاء خطر (ب) إتاحة المزيد من صبغ للدخول.
يسليدر ، وآخرون. الشكل 3. وMicroelectrode سابونين تلف الخلايا المستزرعة. صور تظهر C2C12 myotubes (أ ، ب) وmyoblast C2C12 (ج) قبل الإصابة (أعلاه) وإصابة آخر (القاع). اصابة الخلايا مع microelectrode (أ ، ب) وتظهر MG53 إزفاء إلى مواقع الإصابة (السهام). خلايا تعامل مع سابونين (ج) تبين MG53 إزفاء إلى غشاء الخلية.
Discussion
تشغيل مفرغه هي منهجية مفيدة في توفير تحميل ممارسة للحيوانات المعالجة. كمنهجية لقياس وظيفة العضلات أو القدرة على التحمل وهو نهج صاخبة المعروف أن من الصعب تنفيذ بطريقة استنساخه باستمرار 8. عموما ، يمكن استخدام مرات لاستنفاد باعتبارها نقطة النهاية لحسم الخلافات الرئيسية بين المجموعات التجريبية ، مثل تلك التي بين بعض خطوط الماوس خروج المغلوب والفئران البرية نوع 9. التلاعب التجريبية التي تنتج الفرق أكثر دهاء ، مثل بعض التجارب الدوائية ، قد لا حل الخلافات فوق الضوضاء المصاحبة لهذه التقنية. من أجل تحقيق أقصى قدر من استنساخ وحساسية هذه التقنيات من المهم للحفاظ على شروط الدورة إلى الدورة عن كثب. الوقت من اليوم تمارس هذه الحيوانات ، وكذلك الظروف حتى الفترة الحارة المستخدمة ، هي عوامل مهمة ويجب ان تبقى ثابتة من المحاكمة إلى محاكمة.
يمكن أن الآثار سلالة يكون له أثر كبير على تصميم بروتوكولات مفرغه كما سلالات معينة من الفئران يمكن تشغيلها لفترة أكثر من ذلك بكثير في حلقة مفرغة من السلالات الأخرى ، وتستجيب بشكل مختلف لممارسة التحمل 10. كمبدأ عام ، فإن العديد من الفئران أن تكون قادرة على تشغيل 200-300 متر الإجمالي في دراسة استنفاد مع التزايد المستمر في سرعة مفرغه (5 م / م الأولية مع سرعة 1 م / م المضافة لكل دقيقة بعد بدء). قد لممارسة التحمل يمكن تشغيل الفئران بين 9-12 م / م لمدة 30 دقيقة 2 أو 3 مرات في الأسبوع. ومع ذلك ، فإن الدراسات الفردية وعادة ما يتطلب بعض التحسين على بروتوكول لمباراة تجريبية الاحتياجات الفردية.
وقد تبين أن الإجراء أضرار الأشعة فوق البنفسجية الليزر ليكون وسيلة فعالة لقياس القدرة إصلاح غشاء من ألياف العضلات والهيكل العظمي 3،6،11. واحد عنصرا حيويا لنجاح هذه التجارب لاستخدام الألياف العضلية التي تعرض فقط ، ورود على شكل مستقيم مع ظهور نمط منتظم من التصدعات وغمد الليف العضلي الملساء التي لا تظهر التجاعيد. إذا يتم تحديد ألياف العضلات الأخرى قد يؤدي إلى تلف الغشاء يكون موجودا بالفعل في هذه الألياف وتفسير نتائج هذه التجارب قد تكون معقدة. من المهم أيضا أن تكون على النحو المحدد في اتجاه الألياف وتعريف المنطقة المشع في الشكل 1. هذا يوفر إصابة حجم استنساخه ، مما يسمح بالمقارنة بين الألياف. إذا كانت المنطقة التي تعرف تماما من الاصابة تقع داخل الألياف ، سيتم إنشاء إصابة داخلية بدلا من تعطيل غمد الليف العضلي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن القيمة المحسوبة لΔF / F 0 حساس جدا في المنطقة ذات الاهتمام المحدد لقياس يعني مضان. تبلغ مساحتها حوالي 200μm 2 ، والمحاذية للموقع بما في ذلك الإصابات وغير مناسبة. على عكس المنطقة المحددة للإصابة ، يجب أن هذه المنطقة تقع بالكامل داخل الألياف. إذا قمت بتضمين الفضاء خارج الألياف ، فإن منطقة فارغة مما أدى زيادة ΔF / 0 F في الألياف مع إدخال الصبغة قليلا وفي الوقت نفسه تخفيض ΔF / 0 F في الألياف مع النمط الظاهري أكثر شدة. هذا يقلل من حساسية الفحص ، مما يجعل المقارنة بين ألياف أكثر صعوبة.
لمقايسة micropipette الضرر ، ينبغي أن الزاوية بين micropipette وعاء زجاجي القاع تكون حوالي 45 درجة من أجل الضرر بفعالية في غشاء الخلية. وقد تم اختيار الخلايا للتلف micropipette يجب أن يرفق بإحكام على الجزء السفلي من الطبق ، وينبغي ألا يتم استخدام خلايا مدورة منذ الأرجح أنها سوف تنفصل بعد micropipette بدس. تجارب permeabilzation سابونين هي أقل تطلبا من الناحية الفنية وأسرع نسبيا مقارنة لأداء micropipette المقايسات الاختراق. ومع ذلك ، هناك العديد من القيود على الضرر سابونين ، بما في ذلك ويمكن استخدام خلية واحدة فقط لكل طبق منذ سابونين ومنتشر وتلف خلايا أخرى في هذا الطبق.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | ||
| 70 % ethanol | ISC Bioexpress | ||
| Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 2 mg/ml collagenase type I | Sigma-Aldrich | ||
| 0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| 2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick Scientific | ||
| Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 | |
| LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | ||
| Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| 3 axis micromanipulator | Narishige International | MHW-3 | |
| Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | Bio-Rad | MHW-3 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
References
- Armstrong, R. B., Ogilvie, R. W., Schwane, J. A. Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle. J Appl Physiol. 54, 80-93 (1983).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
- Cai, C. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence. Annu Rev Neurosci. 22, 1-10 (1999).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4592-4597 (2003).
- Cai, C. Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin. J Biol Chem. 284, 15894-15902 (2009).
- Wang, X. Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair. Circ Res. 107, 76-83 (2010).
- Knab, A. M. Repeatability of exercise behaviors in mice. Physiol Behav. 98, 433-440 (2009).
- Zhao, X. Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice. Physiol Genomics. 23, 72-78 (2005).
- Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
- Bansal, D. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
