Summary
यहाँ वर्णित हैं पूरे पशुओं में MG53 की मध्यस्थता सेल झिल्ली की मरम्मत और सेलुलर स्तर पर गतिशील प्रक्रिया कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल. इन विधियों के प्लाज्मा झिल्ली resealing और पुनर्योजी चिकित्सा की कोशिका जीव विज्ञान की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Abstract
कोशिका झिल्ली को गंभीर चोट की मरम्मत सामान्य सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान के एक मौलिक प्रक्रिया है, और दोषपूर्ण झिल्ली की मरम्मत कई अपक्षयी मानव रोगों से जोड़ा गया है. MG53 झिल्ली resealing मशीनरी के एक प्रमुख घटक के रूप में हाल ही में खोज ऊतकों की मरम्मत के बुनियादी जीव विज्ञान, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पुनर्योजी चिकित्सा में संभावित translational अनुप्रयोगों के लिए की एक बेहतर समझ आणविक के लिए अनुमति देता है. यहाँ हम मांसपेशी माउस मॉडल पर पृथक मांसपेशी फाइबर में डाई प्रविष्टि को मापने के द्वारा पूर्व vivo झिल्ली की मरम्मत की क्षमता का परीक्षण करने के लिए ट्रेडमिल व्यायाम प्रोटोकॉल, का उपयोग चोट की मरम्मत में MG53 के vivo समारोह में खोज, और गतिशील प्रक्रिया की निगरानी के लिए के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल विस्तार MG53 की मध्यस्थता पुटिका तस्करी और सुसंस्कृत रहते सेल confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं में कोशिका झिल्ली की मरम्मत की.
Protocol
1. माउस मॉडल में स्नायु चोट की हद तक खुलासा करने के लिए रनिंग ट्रेडमिल
- चल प्रोटोकॉल के दौरान उपयोग के लिए ट्रेडमिल सतह के कोण पर स्थापित करना. आम तौर पर, एक फ्लैट स्तर या 7 ° और 15 ° डिग्री के बीच एक कोण ढलान या ऊपर की ओर किया जाता है. कुछ treadmills अभिन्न इच्छा समायोजित तंत्र में है, जबकि दूसरों को ट्रेडमिल अन्य साधनों के माध्यम से ऊंचा करने की आवश्यकता है.
- ट्रेडमिल में पशुओं को डालने के लिए जानवरों से चल प्रोटोकॉल के दौरान किसी भी अपशिष्ट इकट्ठा एक ट्रे या ट्रेडमिल के नीचे एक नीली प्रयोगशाला पैड से पहले रखें.
- पहले चल रहा है चूहों को ट्रेडमिल के वातावरण के लिए आदत होना चाहिए. इस ट्रेडमिल में पशुओं के बिजली ग्रिड बंद और बेल्ट ड्राइव पर मोटर लेकिन बेल्ट चलती (0 m / s पर सेट गति के साथ अर्थात्) के साथ 15 मिनट के लिए रखने शामिल है.
- प्रेरक बिजली ग्रिड पर मुड़ें. और इस्तेमाल दालों की तीव्रता और आवृत्ति आमतौर पर treadmills पर नियंत्रित किया जा सकता है लेकिन एक निर्माता से दूसरे को बदलता है. आम तौर पर, अधिकतम तीव्रता करने के लिए चूहों को प्रेरित करने के लिए चलाने के लिए है जबकि एक उच्च आवृत्ति (कम से कम एक बार हर दो सेकंड) अनुपालन में सुधार होगा की आवश्यकता नहीं है.
- ट्रेडमिल बेल्ट सक्रिय चल प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए. लगभग 5 मीटर / मिनट की एक प्रारंभिक गति चूहों के लिए एक गर्म अवधि के लिए किया जाना चाहिए. ट्रेडमिल की गति धीरे धीरे जोड़ने 1-2 मीटर / मिनट प्रत्येक मिनट के लिए ट्रेडमिल की शुरुआत के बाद से आमतौर पर, त्वरित किया जा सकता है.
- सबसे प्रोटोकॉल में पशुओं के अनुपालन कम रन (5 मिनट) की एक श्रृंखला का आयोजन 3 से 10 दिनों के लिए गर्म अप गति से पहले प्रयोगात्मक चल रहा शुरू होता है द्वारा सुधार किया जा सकता है.
- (आमतौर पर एक तीव्र थकावट व्यायाम आमतौर पर समय के साथ एक अधिकतम गति तक ट्रेडमिल की गति में वृद्धि भी शामिल होगी <30 मी / मी) हासिल की है और बनाए रखा जब तक चूहों थकावट के लक्षण दिखाने के. थकावट को पहचानने के लिए मानदंड अलग अलग है लेकिन आम तौर पर एक माउस या बिजली ग्रिड पर बिजली ग्रिड 5 लगातार सेकंड पर ट्रेडमिल सतह पर लौटने के बिना समय की तुलना में आधे से अधिक खर्च शामिल है. एक व्यक्ति माउस के बाद समाप्त हो रहा है यह ट्रेडमिल से हटाया जा सकता है और चलाने का कुल समय दर्ज किया जा सकता है.
- ट्रेडमिल का कोण बदलने तीव्र चल परीक्षणों में इस्तेमाल किया जा सकता है व्यायाम लोड (एक कठिन कोण के साथ) को बढ़ाने के लिए या हानिकारक सनकी संकुचन (एक डाउनहिल कोण के साथ) है कि मांसपेशी फाइबर के 1 sarcolemmal झिल्ली आंसू प्रेरित. इवांस नीले डाई histological डाई करने के लिए क्षतिग्रस्त मांसपेशी फाइबर 2,3 की पहचान के रूप में उपयोग के लिए ऐसी प्रक्रियाओं से पहले पशुओं में इंजेक्ट किया जा सकता है है.
- धीरज प्रशिक्षण चल रहा है प्रोटोकॉल जानवर क्रम में मांसपेशियों या हृदय प्रणाली की remodeling उत्पादन समय की एक लम्बी अवधि (महीने के लिए) पर एक व्यायाम लोड प्रदान करते हैं. गर्म प्रक्रिया से ऊपर के रूप में एक ही (1.5 कदम) लेकिन अधिकतम गति आम तौर पर कम है और चल रहा है समय काफी लंबी हो सकती है है (> 1 घंटा) है.
- बाद चूहों चल रहा है के पूरा होने के अपने पिंजरों को लौट जा सकता है. Treadmills आमतौर पर काफी गंदा हो जबकि चूहों लंबे प्रोटोकॉल पर विशेष रूप से चल रहे हैं. ट्रेडमिल साफ है, आम तौर पर एक 70% इथेनॉल स्प्रे के साथ प्रत्येक उपयोग के बाद, यह आवश्यक है.
2. झिल्ली पृथक मांसपेशी फाइबर की मरम्मत क्षमता के पूर्व Vivo परख यूवी लेजर नुकसान के बाद
- माउस पैर से flexor digitorum ब्रेविस मांसपेशियों (FDB) की सतही परत काटना. सबसे पहले, मंझला लाइन पर एकमात्र खोलने की त्वचा में कटौती करते हुए ख्याल रख रही नीचे मांसपेशियों को नुकसान नहीं है, तो क्षैतिज कटौती करने और त्वचा को हटा दें. FDB मांसपेशियों (प्रॉक्सिमल कण्डरा) के फ्लैट सफेद कण्डरा calcaneus हड्डी से जुड़ी देखा जा सकता है. दो टूक संदंश द्वारा कण्डरा अलग और लगाव की साइट कण्डरा करीब तोड़, संदंश द्वारा मुफ्त पट्टा हड़पने और इसे खींच धीरे आसपास के ऊतकों से FDB अलग जबकि किसी भी संयोजी ऊतक कि संलग्न रहते हैं काटने. व्यक्तिगत अंकों FDB काटने जहां इन tendons, मांसपेशियों की गहरी परत के लिए कनेक्ट से हटाया जा सकता है है के लिए बाहर का tendons शाखा देखने पर.
- 1 collagenase समाधान के पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब, एक 37 डिग्री सेल्सियस कक्षीय हिलनेवाला में एक क्षैतिज अभिविन्यास में टेप ट्यूब में और 65 मिनट के लिए 200 rpm पर हिला. मिलीलीटर में FDB मांसपेशियों बंडल रखो टाइम्स ऊष्मायन करने के लिए पर्याप्त पाचन, जो एक अस्तव्यस्त उपस्थिति और मांसपेशियों का पीला रंग ने संकेत दिया है सुनिश्चित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है.
- एक 1.5 μl अपकेंद्रित्र एक कट अंत है कि एक पचा बंडल आसानी से व्यवधान के बिना के माध्यम से पारित करने की अनुमति के लिए पर्याप्त व्यास के साथ एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप के माध्यम से ~ 2.5 2 Ca + Tyrode के 600 μl युक्त ट्यूब में सावधानी से पचा FDB बंडल हस्तांतरण. धीरे ट्यूब फ्लिप करने के बंडल से ढीला फाइबर हिला.
- एक 30 μL विंदुक टिप कट इतना है कि घ(15 के बीच - व्यास में 20 सुक्ष्ममापी) iameter केवल थोड़ा मांसपेशी बंडल की तुलना में छोटी है pipettor प्रयोग धीरे विंदुक में बंडल आकर्षित और फिर यह समाधान में वापस धक्का.. इस प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक तंतुओं के बहुमत के बंडल से disassociated हैं.
- धीरे ट्यूब मोड़ अच्छी तरह से disassociated फाइबर मिक्स, एक गिलास नीचे डेल्टा टी पकवान पर इच्छित राशि और ड्रॉप ले. लोड मात्रा उपयोगी फाइबर है कि एक विशेष प्रोटोकॉल के लिए एक डिश पर की जरूरत है की संख्या के अलगाव और दक्षता के आधार पर अलग अलग होंगे. शेष फाइबर ट्यूब में 4 बजे ° अतिरिक्त अध्ययन के लिए लगभग 6 घंटे के लिए सी संग्रहीत किया जा सकता है.
- 5 मिनट के लिए undisturbed बैठने के पकवान की अनुमति दें. यह फाइबर पकवान की गिलास नीचे का पालन करने के लिए अनुमति देता है.
- एक confocal माइक्रोस्कोपी एक यूवी लेजर के साथ सुसज्जित पर कांच तली पकवान प्लेस. > 100X बढ़ाई चरण माइक्रोस्कोपी के अंतर्गत फाइबर निरीक्षण के लिए एक सामान्य striation पैटर्न और आकार की तरह एक सीधे छड़, की उपस्थिति के लिए जाँच.
- 2.5 5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए हल करने के लिए FM1-43 या FM4-64 रंजक styrylpyridinium 4.
- फाइबर स्थिति यह इमेजिंग विंडो में नुकसान प्रेरित तो फाइबर देखने के नीचे सही करने के लिए फ़ील्ड (चित्रा 1) के बाईं ऊपर से एक ° 45 कोण पर उन्मुख है. प्लाज्मा झिल्ली के एक यूवी लेजर (80 मेगावाट या अधिक से अधिक, 351/364 एनएम) 5 सेकंड के लिए अधिकतम शक्ति के लिए सेट का उपयोग कर एक 5x5 पिक्सेल क्षेत्र (लगभग 0.9μmx0.9μm) चमकाना. विकिरणित क्षेत्र प्लाज्मा झिल्ली को विभाजित करना चाहिए, कि है, 5x5 बॉक्स का आधा फाइबर के अंदर होना चाहिए, जबकि शेष फाइबर (चित्रा 1) से बाहर किया जाना चाहिए.
- डाई प्रविष्टि के प्रत्येक 5 सेकंड के अंतराल पर फाइबर में छवियों पर कब्जा करने के लिए 5 मिनट के लिए.
- पकवान प्रति कोई 3 से अधिक फाइबर के लिए 2.8 कदम दोहराएँ, फ्लोरोसेंट डाई के रूप में अंततः फाइबर में endocytosed जाएगा और किसी भी डेटा विश्लेषण जटिल है. 3 तंतुओं के बाद एक नया पकवान 2.5 कदम से तैयार रहना चाहिए.
- प्रत्येक पर कब्जा कर लिया फ्रेम के बीच प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन (ΔF / एफ 0) की गणना करने के लिए डाई प्रविष्टि की राशि को मापने के द्वारा डेटा का विश्लेषण. यह एक क्षेत्र लगभग 200 सुक्ष्ममापी मतलब प्रतिदीप्ति मापने की आवश्यकता 2 publically उपलब्ध ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) के रूप में विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर . फाइबर के बीच तुलना के लिए, निम्न गणना प्रत्येक फ्रेम के लिए किया जाना चाहिए: ΔF / एफ 0, जहां एफ 0 पहली फ्रेम पर कब्जा कर लिया (टी = 0; चोट करने से पहले) में ब्याज के क्षेत्र का मतलब प्रतिदीप्ति है, और ΔF प्रत्येक बाद फ्रेम के प्रतिदीप्ति में परिवर्तन (0 एफएफ).
3. सेल confocal इमेजिंग लाइव सेल झिल्ली मरम्मत की गतिशील प्रक्रिया मॉनिटर
- Micropipettes Pyrex capillaries से किए गए थे. केशिका एक micropipette खींचने पर रखा गया था और पूर्व निर्धारित कार्यक्रम (= हीट 695; = 50 खींचो, वेळ 55 .=; = समय 250) के द्वारा खींचा.
- Micropipette एक 3 अक्ष micromanipulator (xyz) से जुड़ा था.
- कक्ष प्लाज्मिड डीएनए एक गिलास नीचे डेल्टा टी पकवान पर सामान्य तरीकों का उपयोग कर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं. मीडिया 2.5mm 2 Ca के लिए बंद किया जाना चाहिए + Tyrode बफर से पहले प्रयोगों शुरू .
- ग्लास ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से युक्त व्यंजन 40x 1.3NA तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ एक confocal खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर पर रखा गया.
- तीव्र क्षति रहते सेल कोशिका झिल्ली में micropipette डालने के द्वारा किया गया था और फिर जल्दी से 3,6 सेल के micropipette बाहर वापस लेना . लगातार जीना सेल छवियों 1.54 एस / फ्रेम के एक अंतराल पर प्राप्त किया गया.
- सैपोनिन प्रेरित झिल्ली विघटन परख के लिए, 2.5mm 2 Ca में 0.005% सैपोनिन (सिग्मा) + Tyrode बफर एक गुरुत्व प्रवाह छिड़काव कस्टम इकट्ठे 7 प्रणाली के द्वारा perfused किया गया था. छिड़काव दर लगभग 1 मिलीग्राम / मिनट और छिड़काव टिप imaged सेल जा रहा है ऊपर सीधे रखा जाना चाहिए है.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
माउस ट्रेडमिल चलाने का एक प्रतिनिधि फिल्म शूटिंग के दौरान बनाया जा सकता है है. कंकाल की मांसपेशी को नुकसान की वजह से चूहों फिल्म mg53 / कम चल रहा है क्षमता का उदाहरण देकर स्पष्ट करना होगा.
नुकसान यूवी लेजर ऊपर विस्तृत प्रोटोकॉल की वजह से नुकसान की हद तक विश्लेषण फाइबर की झिल्ली की मरम्मत की क्षमता पर निर्भर करता है. इस क्षमता से जो फाइबर पृथक किया गया माउस के जीनोटाइप, बाह्य परिस्थितियों, और प्रोटीन की अभिव्यक्ति (अभिकर्मक या संक्रमण) के लिए किसी भी परिवर्तन से प्रभावित है. एक सामान्य जंगली प्रकार फाइबर डाई प्रविष्टि (2a चित्रा) उदारवादी मामूली अनुमति देगा. बलवान mg53 / से व्युत्पन्न फाइबर समझौता झिल्ली की मरम्मत की क्षमता के साथ चूहों फाइबर (चित्रा 2b) में डाई की और अधिक महत्वपूर्ण प्रविष्टि प्रदर्शित करेगा .
Microelectrode चोट शो के स्थानान्तरण MG53 युक्त vesi के लिए विशिष्ट परिणामचोट साइट के लिए cles. चित्रा 3a और 3b शो GFP MG53 C2C12 कोशिका झिल्ली में micropipette की प्रविष्टि द्वारा क्षतिग्रस्त myotubes ट्रांसफ़ेक्ट. Micropipette क्षति से पहले कक्ष में, GFP-MG53 दोनों प्लाज्मा झिल्ली और 3 cytoplasm पर स्थित है. Micropipette प्रवेश के बाद, GFP-MG53 युक्त vesicles नुकसान साइटों (के रूप में arrowhead ने संकेत दिया) की ओर चले गए. चित्रा -3 सी एक GFP-MG53 ट्रांसफ़ेक्ट C2C12 saponin के 0.005%, डिटर्जेंट है कि प्लाज्मा झिल्ली permeabilize कर सकते हैं के साथ इलाज किया myoblasts से पता चलता है. सैपोनिन उपचार पर, GFP-MG53 cytosol से कोशिका झिल्ली translocated.
Weisleder, एट अल. चित्रा 1. फाइबर संरेखण और चोट के क्षेत्र परिभाषा दृश्य की परिभाषा और चोट दिखाया क्षेत्र के क्षेत्र के भीतर अलग मांसपेशी फाइबर की उचित उन्मुखीकरण .
Weisleder, एट अल. चित्रा 2. FDB फाइबर छवियाँ. यूवी लेजर क्षति से पहले चोट (0 सेकंड, बाएं) और 200 सेकंड पोस्ट चोट (दाएं) फाइबर दिखा. एक जंगली प्रकार माउस (क) से फाइबर को मामूली चोट दिखाते हैं. समझौता झिल्ली की मरम्मत के साथ चूहों से फाइबर (ख) और अधिक में प्रवेश करने के लिए डाई की अनुमति.
Weisleder, एट अल. चित्रा 3. Microelectrode सैपोनिन और संवर्धित कोशिकाओं को नुकसान छवियाँ C2C12 myotubes (a, b) और एक C2C12 (ग) myoblast चोट (ऊपर) और पोस्ट चोट (नीचे) के लिए पहले दिखा . एक microelectrode (क, ख) के साथ घायल कक्ष चोट साइटों (तीर) MG53 स्थानान्तरण दिखा. सैपोनिन (ग) के साथ इलाज किया कोशिकाओं कोशिका झिल्ली को MG53 स्थानान्तरण दिखा.
Discussion
ट्रेडमिल चल रहे पशुओं का इलाज करने के लिए एक व्यायाम भार प्रदान करने में एक उपयोगी पद्धति है. मापने मांसपेशी समारोह या धीरज क्षमता के लिए एक पद्धति के रूप में यह एक कुख्यात शोर दृष्टिकोण है कि लगातार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य 8 फैशन में निष्पादित करने के लिए मुश्किल है. सामान्य में, थकावट के समय के एक endpoint के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है उन जैसे कुछ पीटकर माउस लाइनों और जंगली प्रकार 9 चूहों के बीच प्रयोगात्मक समूहों के बीच प्रमुख मतभेद हल करने के लिए. प्रायोगिक जोड़तोड़ कि अधिक सूक्ष्म अंतर है, जैसे कुछ दवा परीक्षण का उत्पादन, इस तकनीक के साथ जुड़े शोर ऊपर मतभेद नहीं हल हो सकती है. आदेश में और इन तकनीकों के reproducibility संवेदनशीलता को अधिकतम करने के लिए यह महत्वपूर्ण है सत्र सत्र के लिए स्थिति बहुत बारीकी से बनाए रखने के. दिन के समय जानवरों का प्रयोग कर रहे हैं, के रूप में अच्छी तरह से गर्म अवधि शर्तों के रूप में इस्तेमाल किया, महत्वपूर्ण कारक हैं और परीक्षण से परीक्षण करने के लिए लगातार रहना चाहिए.
तनाव प्रभाव ट्रेडमिल प्रोटोकॉल के डिजाइन पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है चूहों के कुछ उपभेदों के रूप में अन्य उपभेदों से ट्रेडमिल पर बहुत अधिक समय के लिए चलाने के लिए और धीरज 10 व्यायाम करने के लिए अलग प्रतिक्रिया कर सकते हैं कर सकते हैं. एक सामान्य दिशानिर्देश के रूप में, कई चूहों ट्रेडमिल की गति में लगातार वृद्धि (5 मी / मी 1 मी / मी शुरू होने के बाद प्रत्येक मिनट के लिए जोड़ी के साथ प्रारंभिक गति) के साथ एक थकावट अध्ययन में 200-300 मीटर की दूरी पर कुल चलाने के लिए सक्षम हो जाएगा. एक धीरज व्यायाम के लिए चूहों में 30 2 मिनट या 3 बार एक सप्ताह के लिए - 9 से 12 मीटर मी / के बीच चलाया जा सकता है है. हालांकि, व्यक्तिगत अध्ययन आमतौर पर व्यक्तिगत प्रयोगात्मक मैच की जरूरत के लिए प्रोटोकॉल के कुछ अनुकूलन की आवश्यकता होगी.
नुकसान यूवी लेजर प्रक्रिया के कंकाल की मांसपेशी 3,6,11 फाइबर की झिल्ली की मरम्मत की क्षमता को मापने के लिए एक कारगर तरीका होना दिखाया गया है. इन प्रयोगों की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण घटक केवल मांसपेशी फाइबर है कि striations के एक नियमित पैटर्न और एक चिकनी sarcolemma है कि झुर्रियों वाली होती है प्रकट नहीं होता है के साथ एक सीधी, रॉड आकार उपस्थिति प्रदर्शन का उपयोग है. यदि अन्य मांसपेशी फाइबर का चयन कर रहे हैं झिल्ली क्षति पहले से ही इन प्रयोगों से परिणाम की इन तंतुओं और व्याख्या में मौजूद जटिल हो सकता है हो सकता है. यह भी महत्वपूर्ण है कि फाइबर और विकिरणित क्षेत्र की परिभाषा के उन्मुखीकरण के रूप में चित्र 1 में परिभाषित किया जा. यह प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आकार के एक चोट प्रदान करता है, इस प्रकार फाइबर के बीच तुलना की अनुमति है. यदि चोट के परिभाषित क्षेत्र फाइबर के भीतर पूरी तरह झूठ है, एक आंतरिक चोट के बजाय sarcolemma में खलल न डालें बनाया जाएगा. इसके अतिरिक्त, ΔF / एफ 0 के लिए परिकलित मान बहुत मतलब प्रतिदीप्ति की माप के लिए चयनित हित के क्षेत्र के प्रति संवेदनशील है. 200μm लगभग 2, और चोट साइट सहित निकट के एक क्षेत्र उपयुक्त है. चोट के लिए परिभाषित क्षेत्र के विपरीत, इस क्षेत्र में पूरी तरह से फाइबर के भीतर झूठ चाहिए. यदि आप फाइबर के बाहर अंतरिक्ष शामिल हैं, जिसके परिणामस्वरूप रिक्त क्षेत्र थोड़ा डाई प्रवेश के साथ फाइबर में ΔF / 0 एफ वृद्धि जबकि एक और अधिक गंभीर phenotype के साथ फाइबर में ΔF / 0 एफ कम होगा. इस परख की संवेदनशीलता घट जाती है, इस तरह फाइबर के बीच तुलना और अधिक कठिन बना.
Micropipette नुकसान परख के लिए, micropipette और गिलास नीचे पकवान के बीच लगभग 45 डिग्री के कोण के क्रम में करने के लिए प्रभावी ढंग से कोशिका झिल्ली को नुकसान चाहिए. कोशिकाओं micropipette क्षति के लिए चुने गए कसकर पकवान के नीचे करने के लिए संलग्न किया जाना चाहिए और गोल कोशिकाओं के रूप में सबसे अधिक संभावना से उपयोग नहीं किया जा micropipette poking के बाद वे अलग होना चाहिए. Saponin permeabilzation प्रयोगों कम तकनीकी रूप से मांग और अपेक्षाकृत जल्दी करने के लिए पैठ assays micropipette तुलना में प्रदर्शन कर रहे हैं. हालांकि, वहाँ सैपोनिन क्षति के लिए कई सीमाओं कि केवल एक ही कक्ष पकवान प्रति इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद से फैलाना सैपोनिन और है कि डिश में क्षति अन्य कक्षों सहित, कर रहे हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | ||
| 70 % ethanol | ISC Bioexpress | ||
| Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 2 mg/ml collagenase type I | Sigma-Aldrich | ||
| 0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| 2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick Scientific | ||
| Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 | |
| LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | ||
| Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| 3 axis micromanipulator | Narishige International | MHW-3 | |
| Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | Bio-Rad | MHW-3 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
References
- Armstrong, R. B., Ogilvie, R. W., Schwane, J. A. Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle. J Appl Physiol. 54, 80-93 (1983).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
- Cai, C. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence. Annu Rev Neurosci. 22, 1-10 (1999).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4592-4597 (2003).
- Cai, C. Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin. J Biol Chem. 284, 15894-15902 (2009).
- Wang, X. Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair. Circ Res. 107, 76-83 (2010).
- Knab, A. M. Repeatability of exercise behaviors in mice. Physiol Behav. 98, 433-440 (2009).
- Zhao, X. Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice. Physiol Genomics. 23, 72-78 (2005).
- Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
- Bansal, D. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
