Summary
Som beskrivs här är protokoll som används för att visualisera den dynamiska processen MG53-medierad cellmembranet reparation i hela djur och på cellnivå. Dessa metoder kan tillämpas för att undersöka cell biologi plasmamembranet återförslutning och regenerativ medicin.
Abstract
Reparation av akut skada till cellmembranet är en elementär process av normala cellulära fysiologi, och defekta membran reparation har kopplats till många degenerativa sjukdomar hos människor. Den senaste upptäckten av MG53 som en nyckelkomponent i membranet omplombering maskiner ger en ökad molekylär förståelse av de grundläggande biologi vävnad reparera, liksom för potentiella translationell tillämpningar inom regenerativ medicin. Här har vi närmare den experimentella protokoll för att utforska de in vivo-funktionen av MG53 i reparation av muskelskada använda löpband motion protokoll om musmodeller, för att testa ex vivo kapaciteten membran reparera genom att mäta färgen träder i isolerade muskel fibrer och för att övervaka den dynamiska process av MG53-medierad vesikler människohandel och cellmembran reparation i odlade celler med hjälp av levande celler konfokalmikroskopi.
Protocol
1. Löpband Köra för att ha avslöjat omfattningen av muskelskada i musmodeller
- Upprätta vinkeln på löpband ytan för användning under ett pågående protokollet. Generellt, ned eller upp en plan nivå eller en vinkel mellan 7 ° och 15 ° grader används. Några löpband har i väsentlig utrustning för att justera lutningen medan andra kräver löpbandet vara förhöjd på andra sätt.
- Placera ett magasin eller en blå labb pad under löpbandet innan du sätter djuren i löpbandet för att samla in allt avfall från djuren under rinnande protokollet.
- Innan du kör möss bör vara anpassat sig till miljön på löpband. Detta innebär att placera djuren i löpbandet i 15 minuter med elnätet av och bältet drivmotor på men bältet inte rör sig (dvs med hastigheten inställd på 0 m / s).
- Slå på motiverande elnätet. Den intensitet och frekvens av de använda pulser kan vanligen kontrolleras på löpband, men varierar från en tillverkare till en annan. Generellt sett är maximal intensitet behöver inte motivera möss att köra samtidigt som en hög frekvens (minst en gång varannan sekund) kommer att förbättra efterlevnaden.
- Aktivera löpbandet för att börja köra protokollet. En initial hastighet av ungefär 5 meter / minut bör användas för en uppvärmning period för möss. Hastigheten på löpbandet kan påskyndas långsamt, vanligen genom att lägga till 1-2 meter / min för varje minut efter starten av löpbandet.
- Efterlevnad av djur i de flesta protokollen kan förbättras genom att utföra en serie av korta serier (5 minuter) i värma upp hastigheten i 3 till 10 dagar innan den experimentella körs börjar.
- En akut utmattning övning vanligtvis är att öka hastigheten på löpbandet med tiden tills en maximal hastighet (vanligen <30 m / m) uppnås och bibehålls tills mössen visa tecken på trötthet. Kriterier för att bedöma utmattning varierar men i allmänhet omfattar en mus spenderar mer än hälften av tiden på elnätet eller 5 på varandra följande sekunder på elnätet utan att återvända till löpbandet ytan. Efter en enskild mus är uttömda kan det tas bort från löpbandet och den totala tiden för att köra kan registreras.
- Ändra vinkeln på löpband kan användas i akuta körs försök att öka träningsbelastning (med en uppförsbacke vinkel) eller inducera skador excentriska kontraktioner (med en nedförsbacke vinkel) att slita sarcolemmal membranen av muskelfibrer 1. Evans blått färgämne kan injiceras i djur innan sådana förfaranden för användning som en histologisk färgämne för att identifiera skadade muskelfibrer 2,3.
- Uthållighetsträning kör protokoll ger en övning belastning för djuret under en längre tid (upp till månader) för att producera omdaning av muskel eller det kardiovaskulära systemet. Värm upp Proceduren är densamma som ovan (steg 1,5) men den högsta hastigheten är i allmänhet lägre och gångtider kan vara ganska lång (> 1 timme).
- Efter avslutad driva möss kan återvända till sina burar. Löpband brukar bli ganska smutsig medan möss är igång, särskilt under långa protokoll. Det är nödvändigt att rengöra löpbandet, vanligtvis med en 70% etanol spray, efter varje användning.
2. Ex vivo analys av Membrane Reparation kapacitet av isolerade muskelfibrer Efter UV-laser Damage
- Dissekera ut ytliga lagret av flexor digitorum brevis (FDB) muskel från musen foten. Först skär huden på den enda öppna vid mittlinjen samtidigt som man inte skada muskler under, sedan göra horisontella nedskärningar och ta bort skinnet. Den platta vita senan i FDB muskel (proximal sena) kan ses bifogas calcaneus ben. Rakt på sak separera senan med pincett och kapa senan nära platsen för kvarstad, greppa den fria senan med pincett och dra upp den försiktigt för att separera FDB från omgivande vävnader och samtidigt minska eventuella bindväv som sitter kvar. När du ser den distala senor filialen till de enskilda siffrorna i FDB kan tas bort genom att klippa där dessa senor ansluta till djupare lager av muskler.
- Sätt FDB muskeln bunt i 1 ml kollagenas lösning förvärmas till 37 ° C i ett 1,5 ml Eppendorf-rör, tejpa röret i ett horisontell orientering i ett 37 ° C omloppsbanor shaker och skaka vid 200 rpm under 65 min. Times of inkubation kan behöva justeras för att säkerställa tillräcklig matsmältningen, vilket indikeras av en nött utseende och bleka färgen på muskeln.
- Försiktigt överföra rötas FDB bunt i en 1,5 l centrifugrör innehållande ~ 600 ìl 2,5 Ca 2 + Tyrode via en 1 ml pipettspets med ett snitt ände som har en diameter tillräckligt stor för att smälta bunten till lätt passera utan störningar. Försiktigt vända röret att skaka loss fibrer från bunten.
- Skär en 30 mikroliter pipettspetsen så att diameter är bara något mindre än en muskel paket (mellan 15 - 20 mikrometer i diameter) Använd pipett för att försiktigt dra bunt i pipetten och skjut tillbaka den i lösningen.. Upprepa denna process tills majoriteten av fibrerna skiljas från bunten.
- Blanda skiljas fibrer väl genom att försiktigt vrida röret, ta önskad mängd och släpp på ett glas-bottom Delta T maträtt. Volymen för att ladda varierar beroende på effektiviteten av isolering och antalet nyttiga fibrer som behövs på en maträtt för ett visst protokoll. Den återstående fibrerna kan lagras i röret vid 4 ° C i ca 6 timmar för ytterligare undersökningar.
- Låt skålen stå orörd i 5 minuter. Detta gör att fibrerna att hålla fast glaset botten av skålen.
- Placera glaset botten maträtt på en konfokalmikroskopi utrustad med en UV-laser. Observera fibrerna under fas mikroskopi vid> 100X förstoring för att kontrollera förekomsten av en normal ränder mönster och en rak stång som form.
- Lägg FM1-43 eller FM4-64 styrylpyridinium färgämnen 4 till lösning till en slutlig koncentration av 2,5 mikroM 5.
- Att få skador på fibern placera den i bildbehandling fönster så att fiber är orienterade i 45 graders vinkel från toppen till vänster i synfältet längst ned till höger (Figur 1). Bestråla en 5x5 pixel område (ca 0.9μmx0.9μm) av plasmamembranet med hjälp av en UV-laser (80 mW eller mer, 351/364 nm) inställd på maximal effekt under 5 sekunder. Den bestrålade regionen bör dela plasmamembranet, det vill säga hälften av 5x5 lådan bör vara inne i fibern, medan resten ska vara utanför fiber (Figur 1).
- Ta bilder färgämne inträde i fibern i intervaller om 5 sekunder vardera för upp till 5 minuter.
- Upprepa steg 2,8 högst 3 fibrer per fat, eftersom fluorescerande färg kommer så småningom att endocyteras in i fibern och komplicera data analys. Efter 3 fibrer en ny maträtt bör förberedas från steg 2,5.
- Analysera data genom att beräkna förändringen i fluorescensintensitet (ΔF / F 0) mellan varje fångade ram för att mäta mängden färgämne inträde. Detta kräver att mäta medelvärdet fluorescens av ett område cirka 200 ìm 2 med hjälp av analys programvara som allmänt tillgänglig ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). För jämförelse mellan fibrer bör följande beräkning göras för varje bildruta: ΔF / F 0, där F 0 är medelvärdet fluorescens i regionen av intresse i den tagna första bildrutan (t = 0; före skada), och ΔF är förändringen i fluorescens varje efterföljande bildruta (FF 0).
3. Levande cell Confocal Imaging att övervaka den dynamiska processen av cellmembran Reparation
- Mikropipetter gjordes från PYREX kapillärer. Den kapillära var placerad på en mikropipett avdragare och drog med förinställda program (Heat = 695, Pull = 50; Vel .= 55, Tid = 250).
- Mikropipett var knuten till en 3 axel (xyz) mikromanipulator.
- Celler är transfererats med plasmid-DNA med normala metoder på ett glas botten Delta T maträtt. Media bör byta till 2,5 mm Ca 2 + Tyrode buffert innan experimenten börja.
- Glas rätter som innehåller transfekterade celler placerades på en laserskanning konfokalmikroskop med 40x 1.3NA oljeimmersion mål.
- Den akuta live-cellskador utfördes genom att föra in mikropipett i cellmembranet och sedan snabbt dra tillbaka mikropipett ut ur cellen 3,6. I följd levande cell bilder erhölls med ett intervall på 1,54 s / ram.
- För den inducerade saponin membranet störningar analys, + Tyrode buffert 0,005% saponin (Sigma) i 2,5 mm Ca 2 var perfusion av en allvar-flöde anpassade monterade perfusion systemet 7. Den perfusionshastighet är cirka 1 ml / min och perfusionen spetsen bör placeras direkt ovanför den cell som avbildas.
4. Representativa resultat:
En representant film av musen löpband igång kan göras under inspelningen. Filmen kommer att illustrera den minskade drift kapacitet mg53-/ - möss på grund av skador på skelettmuskulaturen.
Omfattningen av skador orsakade av UV-laser skador protokoll anges ovan beror på membranet reparation kapacitet analyserades fiber. Denna förmåga påverkas av genotyp av musen som fibrerna var isolerat, extracellulära villkor, och varje ändring proteinuttryck (transfektion eller infektion). En normal vildtyp fiber kommer att tillåta en liten till måttlig färga in (Figur 2a). Muskelfiber härrör från mg53-/ - möss med nedsatt membran reparation kapacitet kommer att visa mer betydande inträde av färg i fiber (Figur 2b).
Typiska resultat mikroelektrod skada visar förflyttning av MG53 som innehåller Vesilarna till skadan webbplats. Figur 3a och 3b visar GFP-MG53 transfekterade C2C12 myotubes skadas av införandet av mikropipett i cellmembranet. I cellen innan mikropipett skador är GFP-MG53 ligger på både plasma membranet och cytoplasman 3. Efter mikropipett penetration flyttade GFP-MG53 innehåller vesiklar mot skada områden (som framgår av pilspets). Bild 3c visar en GFP-MG53 transfekterade C2C12 myoblasts behandlades med 0,005% av saponin, ett rengöringsmedel som kan permeabilize plasmamembranet. Vid saponin behandling, GFP-MG53 flyttas från cytosolen till cellmembranet.
Weisleder, et al. Figur 1. Fiber anpassning och skador regionen definition. Rätt orientering av de isolerade muskelfibrer inom synfältet och definition av den visade skadan regionen.
Weisleder, et al. Figur 2. UV-laser skada av FDB fiber. Bilderna visar fibrer före skadan (0 sek, vänster) och vid 200 sekunder efter skada (till höger). Fibrer från en vild typ mus (en) visar lindrig skada. Fibrer från möss med nedsatt membran reparation (b) tillåta mer färgämne komma in.
Weisleder, et al. Figur 3. Mikroelektrod och saponin skador på odlade celler. Bilderna visar C2C12 myotubes (a, b) och en C2C12 myoblast (c) innan skada (ovan) och efter skada (botten). Celler skadade med en mikroelektrod (a, b) visar MG53 translokation till skada webbplatser (pilar). Celler som behandlats med saponin (c) visar MG53 translokation till cellmembranet.
Discussion
Löpband kör är en användbar metod för att ge en övning belastning på behandlade djur. Som en metod för att mäta muskel funktion eller uthållighet kapacitet är det ett ökänt bullrig metod som är svår att genomföra på ett konsekvent reproducerbart sätt 8. I allmänhet kan ibland till utmattning ska användas som en slutpunkt för att lösa stora skillnader mellan experimentella grupper, till exempel mellan vissa linjer Knockoutmusens och vilda möss typ 9. Experimentella manipulationer som producerar mer subtila skillnaden, till exempel vissa läkemedel försök, inte kan lösa meningsskiljaktigheter över bullret i samband med denna teknik. För att maximera reproducerbarhet och känslighet för dessa tekniker är det viktigt att upprätthålla villkoren för sessionerna mycket noga. Vilken tid på dagen djuren utnyttjas, liksom varm period som används förhållanden, är viktiga faktorer och bör stanna konsekvent från studie till studie.
Sila effekter kan ha en betydande inverkan på utformningen av löpbandet protokoll som vissa stammar av möss kan köra för mycket mer tid på löpband än andra stammar och reagerar olika på uthållighetsträning 10. Som en allmän riktlinje, kommer många möss att kunna köra 200-300 totala meter i en utmattning studie med konstant ökning av hastigheten på löpbandet (5 m / m utgångshastighet med 1 m / m tillkommer för varje minut efter start). För en uthållighet utöva möss kan köras mellan 9 till 12 m / m för 30 minuter två eller tre gånger i veckan. Däremot kommer enskilda studier kräver oftast någon optimering av protokoll för att matcha individuella experimentella behov.
UV-laser skada förfarande har visat sig vara en effektiv metod för att mäta kapaciteten membranet reparation av skelettmuskulatur fibrer 3,6,11. En viktig del till framgången med dessa försök är att använda bara muskelfibrer som visar en rak, stavformade utseende med ett regelbundet mönster av strimmor och en smidig sarcolemma som inte visas skrynkliga. Om andra muskelfibrer är valda membranet skador kan redan finnas i dessa fibrer och tolkning av resultat från dessa experiment kan vara komplicerat. Det är också viktigt att inriktningen på fiber och definition av bestrålade området som definieras i figur 1. Detta ger en skada reproducerbar storlek, vilket möjliggör jämförelser mellan fibrer. Om den definierade regionen skada ligger helt inom fiber, kommer en intern skada skapas snarare än att störa sarcolemma. Dessutom är det värde som beräknas för ΔF / F 0 mycket känslig för regionen av intresse valts ut för mätning av medelvärdet fluorescens. Ett område på ca 200μm 2, som gränsar till och med skada plats, är lämplig. Till skillnad från den region som definierats för skada, bör denna areal ligger helt inom fiber. Om du inkluderar utrymme utanför fiber, kommer den resulterande tomma området öka ΔF / F 0 i fibrer med lite färg inträde samtidigt sänka ΔF / F 0 i fibrer med en svårare fenotyp. Detta minskar känsligheten i analysen, vilket gör jämförelser mellan fibrerna svårare.
För mikropipett skador analysen bör vinkeln mellan mikropipett och glas nedre skålen vara cirka 45 grader för att effektivt förstöra cellmembranet. Cellerna valdes för mikropipett skador bör vara hårt knuten till botten av skålen och rundade celler bör inte användas eftersom de flesta sannolikt att de kommer loss efter mikropipetten peta. Saponin permeabilzation experiment är mindre tekniskt krävande och relativt snabbare att utföra än mikropipett penetration analyser. Det finns dock flera begränsningar saponin skador, bland annat att endast en cell kan användas per fat sedan saponin kommer att spridas och skada andra celler i skålen.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rodent treadmill | Columbus Instruments Exer 3/6 or equivalent | ||
| 70 % ethanol | ISC Bioexpress | ||
| Dissection tools including fine tip forceps, spring scissors | World Precision Instruments, Inc. | ||
| 2 mg/ml collagenase type I | Sigma-Aldrich | ||
| 0 Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| 2.5mM Ca2+ Tyrode buffer (140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, pH 7.2, 290 mosm) | Sigma-Aldrich | ||
| Temperature controllable orbital shaker | New Brunswick Scientific | ||
| Delta TPG Dish | Fisher Scientific | 1207133 | |
| LSM 510 confocal microscope with an Enterprise 80 mW UV laser or equivalent confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| FM1-43 or FM4-64 dyes | Invitrogen | ||
| Borosilicate Capillaries Size 0.8-1.0 X 100 mm | PYREX | Part No. 9530-2 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | model P-97 | |
| 3 axis micromanipulator | Narishige International | MHW-3 | |
| Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope | Bio-Rad | MHW-3 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
References
- Armstrong, R. B., Ogilvie, R. W., Schwane, J. A. Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle. J Appl Physiol. 54, 80-93 (1983).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
- Cai, C. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence. Annu Rev Neurosci. 22, 1-10 (1999).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4592-4597 (2003).
- Cai, C. Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin. J Biol Chem. 284, 15894-15902 (2009).
- Wang, X. Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair. Circ Res. 107, 76-83 (2010).
- Knab, A. M. Repeatability of exercise behaviors in mice. Physiol Behav. 98, 433-440 (2009).
- Zhao, X. Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice. Physiol Genomics. 23, 72-78 (2005).
- Massett, M. P., Berk, B. C. Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288, 1006-1013 (2005).
- Bansal, D. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
