Summary
אנו מתארים פרוטוקול עבור microfabrication של המכשיר שיפוע מניבות microfluidic כי ניתן להפיק הדרגתיים במרחב ובזמן ב microenvironment מוגדרים היטב. בגישה זו, המכשיר שיפוע מניבות microfluidic ניתן להשתמש כדי ללמוד נדידת תאים מכוונת, embryogenesis, ריפוי פצעים, ועל גרורות סרטניות.
Abstract
ייצור ותפעול של המכשיר שיפוע מניבות microfluidic לחקר התנהגות תאית מתואר. פלטפורמה microfluidic הוא כלי ניסיוני המאפשר, כי זה יכול דווקא לתפעל זורם נוזל, לאפשר תפוקה גבוהה ניסויים, וליצור יציבות הדרגתיים ריכוז מסיסים. בהשוואה גנרטורים שיפוע קונבנציונלי, פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) מכשירים microfluidic מבוסס יכול ליצור מעברים הדרגתיים ריכוז יציב של גורמי גדילה עם פרופילים מוגדרים היטב. הנה, פיתחנו פשוט שיפוע מניבות מכשירים microfluidic עם שלושה פתחי הכניסה נפרדת. שלושה microchannels לשלב אחד microchannel ליצור מעברים הדרגתיים ריכוז. היציבות ואת הצורה של הדרגתיים גורם גדילה אושרו על ידי והעמסת isothyiocyanate (FITC)-dextran עם משקל מולקולרי דומה גורם הגדילה באפידרמיס (EGF). שימוש המכשיר microfluidic, הראינו כי fibroblasts חשופים הדרגתיים ריכוז של EGF נדדו לעבר ריכוזים גבוהים יותר. התמצאות כיוונית של נדידת תאים ו תנועתיות של תאים נודדים הוערכו כמותית על ידי ניתוח התא מעקב. לפיכך, התקן זה שיפוע מניבות microfluidic עשוי להיות שימושי עבור לימוד וניתוח התנהגותם של תאים נודדים.
Protocol
א Microfabrication של המכשיר שיפוע מניבות microfluidic
- רקיק סי מטופל עם פלזמה החמצן מגיב (5 דקות ב 30W, Harrick מדעי, ניו יורק).
- Photoresist שלילית (SU-8 50, Microchem, MA) היא ספין מצופה בסל"ד 1000 דקות 1 על פרוסות סיליקון Si.
- רקיק הוא רך אפוי על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על פלטה חמה.
- רקיק הוא נחשף לאור UV (200W) עבור 3 דקות דרך מסכה שקיפות עם גודל התכונה מינימלי של 30 מיקרומטר.
- רקיק הוא שלאחר אפוי על 65 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות ו - 95 ב מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- סי עובש הורים עם 100 ערוצי מיקרומטר עבה הוא פותח באמצעות SU-8 מפתח photoresist.
- רקיק המכיל microchannels מושם בצלחת פטרי,.
- תבניות פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184) מיוצרים על ידי אלסטומר סיליקון ערבוב סוכן ריפוי (יחס 10:01).
- התערובת PDMS הוא שפך על עובש האב סי.
- עובש האב סי מושם על ייבוש ואקום כדי להסיר בועות במשך 10 דקות.
- PDMS נירפאים ב 70 ° C עבור 1 ~ 2 שעות.
- תבניות PDMS הן קילף מהתבנית האב סי.
ב ניסויית ההתקנה
- כניסת Cell, מוצא, וכן יציקת פתחי הכניסה של המכשיר PDMS מבוסס microfluidic הם חבט באמצעות הבוקרים חדה.
- מכשיר ו שקופיות הזכוכית (2 × 3 ס"מ) מודבקים באופן בלתי הפיך על ידי הפלזמה החמצן מגיב (5 דקות ב 30W, Harrick מדעי, ניו יורק).
- צינורות פוליאתילן (PE 20, בקטון Dickinon, MD) הוא מוכנס לתוך פתחי הכניסה יציקת של המכשיר microfluidic ומחוברים לאחר מכן משאבת מזרק.
- Isothiocyanate והעמסת (FITC)-dextran (MW = 10kD, 10 מיקרומטר, Sigma) ו חיץ (PBS, Invitrogen, CA) הם החדיר לתוך המכשיר microfluidic לאשר הדרגתיים יציבה בתוך המכשיר fluidic.
- תאי מטריקס (ECM) (כלומר, פיברונקטין) מצופה בתוך המכשיר microfluidic שעה 1 ב בחממה (37 ° C).
- תאים פיברובלסטים NIH 3T3 הם trypsinized ו ניתק.
- תאים ניתק נטענים לתוך המכשיר microfluidic (800 מיקרומטר רחב) בשעה צפיפות התא של 2 × 10 6 תאים / מ"ל.
- 2 מדיה מ"ל ו 50 ng / ml גורם צמיחה אפידרמיס (EGF), הוא החדיר לתוך מכשיר microfluidic להפקת הדרגתיים מסיסים באמצעות משאבת מזרק (0.05 μl / min).
- תאים הם בזמן אמת לנטר כל 5 דקות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה (ניקון TE 2000).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תאים שנחשפו הדרגתיים ריכוז יציב של EGF במכשיר microfluidic נדדו לעבר ריכוזים גבוהים יותר. התמצאות כיוונית של נדידת תאים, מדד chemotactic, תנועתיות של תאים נודדים נחקרו על ידי ניתוח התא מעקב. לכן, זו פלטפורמה שיפוע מניבות microfluidic יכול להיות שימושי עבור לימוד גרורות סרטן, embryogenesis, והכוונה האקסון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | FD10S | Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | human recombinant Epidermal growth factor | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Si wafer | silicone wafer, 4 inch | |||
| Petri dishes | ||||
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectin | ||||
| NIH 3T3 | cell-line | fibroblast cells | ||
| Inverted microscope | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
- Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).
- Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5, 401-406 (2005).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).
- Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform. BMC Biotechnol. 7, (2007).
