Summary
我々は明確に定義された微小環境における空間的および時間的勾配を生成することができる勾配を発生するマイクロ流体デバイスの微細加工のためのプロトコルについて説明します。このアプローチでは、勾配を発生するマイクロ流体デバイスは、指示細胞の遊走、胚形成、創傷治癒、癌の転移を研究するために使用することができます。
Abstract
細胞挙動を研究するための勾配を生み出すマイクロ流体デバイスの作製と動作について説明する。それは正確に、流体の流れを操作するハイスループット実験を可能にし、安定した水溶性の濃度勾配を生成することがあるため、マイクロ流体プラットフォームは、可能にする実験的なツールです。 、従来の勾配の発電機に比べ、ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）ベースのマイクロ流体デバイスは、明確に定義されたプロファイルを持つ成長因子の安定した濃度勾配を生成することができます。ここで、我々は3つの別々の入口で、単純な勾配を発生するマイクロ流体デバイスを開発した。三マイクロチャネルは、濃度勾配を生成するマイクロチャネルつに結合。成長因子の勾配の安定性と形状は、上皮成長因子（EGF）と同様の分子量とフルオレセインisothyiocyanate（FITC）-デキストランによって確認された。このマイクロ流体デバイスを用いて、我々は、線維芽細胞が高濃度に向かって移行したEGFの濃度勾配にさらされることを示した。細胞の遊走および遊走細胞の運動性の指向方向を定量的に細胞トラッキング解析により評価した。従って、この勾配を発生するマイクロ流体デバイスは、遊走細胞の挙動を研究し、分析するための役に立つかもしれません。
Protocol
勾配を発生するマイクロ流体デバイスのA.の微細加工
- Siウェハは、活性酸素プラズマ（30W、Harrick科学、NYで5分）で処理される。
- ネガ型フォトレジスト（SU - 8 50、マイクロケム、MA）は、Siウエハ上に1分間1000 rpmでスピンコートです。
- ウェハは、65℃焼きソフトです95℃、その後10分、°ホットプレート上で30分間のためのC。
- ウェハは30μmの最小機能サイズは透明マスクを介して3分間UVライト（200W）に公開されます。
- ウェハは65で焼成した後で1分間及び95℃C℃で10分間。です。
- 厚さ100μmのチャネルを有するSiマスターモールドは、SU - 8フォトレジストの現像剤を使用して開発されています。
- マイクロチャネルを含むウェハは、ペトリ皿に配置されます。
- ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）（Sylgard 184）金型は、混合シリコーンエラストマーと硬化剤（10:1比）によって製造される。
- PDMSの混合物はSiマスターモールドの上に注がれています。
- Siのマスターモールドを10分間気泡を除去するため真空デシケーターに配置されます。
- PDMSは、1〜2時間、70℃で硬化させる。
- PDMSモールドはSiマスターモールドから剥離されています。
B.実験セットアップ
- PDMSベースのマイクロ流体デバイスの細胞の入口、出口、および注入口は鋭いパンチャーを使用してパンチされています。
- デバイスとスライドガラスは（2 × 3インチ）不可逆的に活性酸素をプラズマ（30W、Harrick科学、NYで5分）によって接合される。
- ポリエチレンチューブ（PE 20、ベクトンDickinon、MD）は、マイクロ流体デバイスの注入注入口に挿入し、その後、シリンジポンプに接続されています。
- フルオレセインイソチオシアネート（FITC）-デキストラン（MW = 10kD、10μM、シグマ）とバッファが（PBS、Invitrogen社、カリフォルニア州）流体デバイス内部の安定勾配を確認するためのマイクロ流体デバイスに注入されています。
- 細胞外マトリックス（ECM）（すなわち、フィブロネクチンは）インキュベーターで1時間（37℃）のためにマイクロ流体デバイスの内部にコーティングされています。
- NIH 3T3繊維芽細胞はトリプシン処理し、解離する。
- 解離細胞は、2の細胞密度でのマイクロ流体デバイス（800μm幅）× 10 6細胞/ mlにロードされます。
- 2 mlの培地と50 ng / mlの上皮増殖因子（EGF）は、シリンジポンプ（0.05μL/ min）を用いて水溶性勾配を発生させるためのマイクロ流体デバイスに注入される。
- 細胞は、リアルタイム倒立顕微鏡（ニコンTE 2000）を使用して5分ごとに監視されています。
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Discussion
細胞が高濃度に向かって移行したマイクロ流体デバイスにおけるEGFの安定した濃度勾配にさらされる。細胞遊走、走化インデックス、遊走細胞の運動性の指向方向はセルのトラッキング分析により調べた。したがって、この勾配を発生するマイクロ流体プラットフォームは、癌転移、胚形成、軸索のガイダンスを研究するために有用である可能性があります。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-FITC | Reagent | Sigma-Aldrich | FD10S | Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD) |
| hr-EGF | Invitrogen | 13247-051 | human recombinant Epidermal growth factor | |
| PDMS | K.R. Anderson Co. | 2065622 | Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb) | |
| Negative photoresist | MicroChem Corp. | SU-8 50 | ||
| Si wafer | silicone wafer, 4 inch | |||
| Petri dishes | ||||
| Polyethylene tubing | BD Biosciences | PE 20 | ||
| PBS | Invitrogen | |||
| Fibronectin | ||||
| NIH 3T3 | cell-line | fibroblast cells | ||
| Inverted microscope | Nikon Instruments | TE 2000 |
References
- Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).
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