3D楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

Summary

我々は、細胞 - 細胞相互作用の違いを定量化するために三次元組織のような回転楕円体とそれらの潜在的なアプリケーションを生成する単純な、急速な方法を説明します。

Abstract

細胞間の凝集と細胞 - 基質接着の研究は歴史的に硬質基材への付着性単層培養で行われている。組織内の細胞は、しかし、一般的に細胞は多くの近い隣人とし、細胞外マトリックス成分との親密な接続を確立した最密充填組織塊内に収められています。したがって、化学的環境と3次元組織内の細胞が経験する物理的な力は、単層培養で増殖させた細胞で経験したものよりも根本的に異なっています。これは、著しく細胞形態及びシグナル伝達に影響を与えることが示されている。いくつかのメソッドは、コラーゲンゲル¹または生体材料足場²のセルのカプセル化を含む3次元細胞培養を生成するために考案されている。このような方法は、便利な一方、正常組織に見られる親密な直接細胞間接着のアーキテクチャを要約することはありません。単一の細胞が疎なECM製品の3次元網目構造内に分散されているのではなく、彼らがより密接に近似する培養システム。ここで、我々は、彼らは、細胞同士や細胞外マトリックス成分と直接接触している真の3D回転楕円体を形成するまで細胞がドロップ文化をハング内に配置し、生理的条件下でインキュベートされる、単純な方法を説明します。メソッドは特殊な装置を必要とせず、細胞間または細胞- ECM相互作用への影響を解明することに関心があると思われる非常に少量の任意の生物学的因子の付加を含むように適合させることができます。メソッドは、セル間の空間関係を指定するには、細胞間や細胞 - ECM間の相互作用の役割を解明するために共培養つ（以上）の異なる細胞集団にも使用できます。細胞間の凝集と細胞- ECMの接着は胚発生の研究の基礎、悪性浸潤における腫瘍間質細胞の相互作用、創傷治癒、及び組織工学への応用のためです。この簡単な方法は、生体力学的特性の測定のためのまたは生理学的に関連するモデルの分子的および生化学的解析のための細胞凝集のような組織を生成する手段を提供します。

Protocol

1。単一の細胞懸濁液の調製

1. 接着細胞の培養は90％のコンフルエンスまで増殖されるべきである、whereupon単層をPBSで2回リンスする必要があります。よく排水後、0.05％トリプシン- 1mMのEDTAの2 MLSを（100 mmプレートの場合）追加し、37℃での細胞がデタッチされるまで。完全培地の2 MLSを追加することにより、トリプシン処理を停止し、静かに、細胞が懸濁液になるまで混合物を砕いて粉にするために5 mlのピ​​ペットを使用してください。 15 mlコニカルチューブに細胞を移す。
2. 室温で5分間に10 mg / mlのDNase株式とインキュベートの40μlを添加する。 5分間200 xgで軽くボルテックスして、遠心。
3. 上清を捨て、1mlの完全な組織培養の培地でペレットを洗浄。繰り返しますが、その後、完全な組織培養培地の2 MLSで細胞を懸濁します。
4. 血球計算盤、または自動細胞計数装置を用いて細胞をカウントし、2.5 × 10 ⁶細胞/ mlに濃度を調整する。このデモではBioRad社TC10自動細胞計数装置を用いた。

2。ハンギングドロップの形成。

1. 60 mmの組織培養皿と皿の底の場所のPBS 5mlのをから蓋を外します。これは、水和室として機能します。
2. 蓋を逆さにして蓋の底部上に10μlの滴を堆積させるために20μlのピペッターを使用してください。触れないでするように十分離れてドロップが配置されていることを確認してください。皿ごとに少なくとも20滴を配置することが可能です。
3. 37 PBS -満ちボトムチャンバーとインキュベート℃/ 5％CO ₂ /湿度95％の上にふたを反転させる、毎日の低下を監視し、細胞シートまたは凝集体のいずれかが形成するまでインキュベートする。ステレオ顕微鏡は、凝集体形成を評価するために使用することができます。
4. 一度シートの形、それらが回転楕円体の形になるまで℃、5％CO _2を完全培地の3のMLSを含む丸底ガラスシェーカーフラスコに移し、37で振とう水浴中でインキュベートすることができます。

3。ノート

1. セルのサイズに応じて、濃度が上下調整する必要があります。
2. 細胞は、膜はハンギングドロップ形成する前に蛍光色素を吸蔵で染色することができます。
3. 二つの異なる細胞型を差動でぶら下がっ滴の形成前に1:1（またはその他）の割合で染色し、混在させることができます。これらは遺伝的に特定の接着剤の署名を持つように設計癌と間質細胞、胚組織、または細胞であり得る。
4. 細胞は、カドヘリンの機能を維持するために0.05％トリプシン/ 2 mMのカルシウムを使用して組織培養皿から剥離することができます。
5. 実験によっては、用紙サイズはいずれかで測定することができる、または集計は機械的な試験や生化学的または分子解析のために使用することができます。

4。代表的な結果：

シートまたは回転楕円体の形成は、通常24時間以内に起こるが、細胞の種類に応じて時間がかかることがあります。図1は、未治療前立腺癌MAT - LyLu（MLL）ドロップ文化を吊り下げ中の細胞（図1A）または25μmのMEK阻害剤PD98059で処理した細胞のインキュベーションの18時間後に撮影した画像を表します。細胞シートの著しい圧縮におけるそのMEKiの治療の結果に注意してください。圧縮は10-20のサイズ（またはそれ以上）滴を吊り下げ、治療群間の平均サイズを比較して測定することによって定量することができます。我々はピクセル単位で画像全体の面積を明らかにするために、粒子の分析を適用するとすぐに我々は一般的に、バイナリモードに画像を、各画像を閾値変換することにより、ImageJのソフトウェアを使用して画像を分析する。これは、その後、簡単に平方ミクロンに変換することができます。図2は、未処理とMEKi処理MLL細胞のサイズの比較を表しています。スチューデントt -検定（P <0.0001）で比較して、前述したように、MEKiの治療は大幅にシートサイズを減らします。この比較のために、未処理及び処理した細胞の各10凝集体を測定した。図3は、ドロップの文化をぶら下げで24時間とシェーカーバスで2日後に形成されたニワトリ胚肝臓の回転楕円体を表しています。

ハンギングドロップアッセイはまた、採択された空間的位置を明らかにするために複数の細胞型を含むように変更することができます。例えば、ニワトリ胚の肝細胞は、蛍光膜 - インターカレート色素で染色し、別の蛍光マーカーで染色されているニワトリ胚心臓の細胞と混合した、単離することができる。混在したままになることではなく、図4Aに示すように、肝臓や心臓の細胞は一から別の"アウト並べ替え"と心臓の細胞が肝細胞に包まれている球の内、球の構成を採用する傾向がある。この設定は、肝臓と心臓の細胞間の細胞間接着の違いによって説明できる。この概念は、膵島細胞の組織⁵用とi同一の2つの細胞集団の間で細胞選別のため、両生類の³と硬骨魚類⁴胚の胚性生殖層の組織との間の細胞ソートの動作を説明するために使用されている差動接着仮説に成文化されNカドヘリン^（6および図4B）の同じ種類の発現レベル以外のすべての点。この結果は、細胞集団の間の接着の単純な違いをエンジニアリング方法を実演するために特に重要なのは、例えば、臓器の構造の発生につながる可能性、膵島^5。

図1のどちらかが存在しない（A）または存在下で18時間点滴培養をぶら下げでインキュベートした細胞の画像（B）のMEK阻害剤PD98059の25μmの。画像は、ニコンのEclipse TE 300落射蛍光顕微鏡とPhotometrics CoolSnap ESデジタルカメラを使用して捕獲された。

図2。ラット前立腺癌MLL細胞のMEKi誘発性圧縮の定量。上記のような凝集体サイズを決定したとすぐに未処理とMEKi処理MLL細胞のハンギングドロップ培養を18時間インキュベートした。凝集体サイズの統計的分析はスチューデントt検定によって行った。アスタリスクは、未処理とMEKi処理細胞間の集約サイズで統計学的有意差（P <0.0001）を表し、その有意に小さく、よりコンパクトな集合体でMEKi処理の結果を示唆している。

図3。インキュベーターにして18時間点滴培養を吊り下げ/ 48時間風呂を振りにニワトリ胚肝細胞をインキュベートすることによって形成された回転楕円体。この画像は、Nikon SMZ800ステレオ顕微鏡とソニーブラックCCDカメラを用いて捕獲された。

図4。ドロップの文化を吊るすには、異なる種類の細胞の間にソートアウト挙動を明らかにする。パネルでは、ニワトリ胚の肝細胞がPKH - 2膜インターカレート色素で染色し、PKH - 26ステンドニワトリ胚心臓の細胞と同じ割合で混合。パネルBでは、二つのN -カドヘリン-トランスフェクトL細胞クローン（LN4とLN2a）、2.4:1の比率で、その表面でのN - CADを表現するには、また、蛍光膜インターカレート色素PKH - 2、PKH - 26で染色した、（Sigma - Aldrich）を、等しい割合で混合し、滴^7を吊り下げて培養した。文化の中で18時間後、細胞シートは、振盪フラスコに移し、さらに48時間インキュベートした。集計がに2％パラホルムアルデヒドで固定したリン酸緩衝生理食塩水とニコンオプチフォト- 2顕微鏡に接続されているバイオラッドMRC600走査型レーザー共焦点顕微鏡システムで表示。緑と赤の両方のチャンネルからの光学切片を採取したとVital Imagesはボクセルビューウルトラのイメージングソフトウェアを搭載したシリコングラフィックスクリムゾンVGXのワークステーションは、両方のチャンネルに偽色を割り当てることや画像をマージするために、生成された解剖学的構成を明らかに使用されていました。（）擬似カラー青の肝細胞^（8から）で心臓の細胞（ここで疑似カラーの黄色の）の包囲を示す集約を通じて、共焦点光学セクション。 N -カドヘリン（赤^）（6）の低レベルを発現することにより、高N -カドヘリンを発現する細胞（緑色）の集合体を実証包囲から（B）共焦点光学部。

Discussion

研究では、三次元コンテキスト（3D）での培養細胞が異なる細胞の形態とリジッド2次元（2D）文化系⁹と比較してシグナル伝達をもたらすことが示されている。例えば、線維芽細胞に移入コラーゲンゲルは、3Dでの線維芽細胞の形態は、2D ^10,11で観察されたものとはかなり異なっていることを示しています。同様に、三次元培養では、乳腺上皮細胞の組織特異的分化を誘導することができる。 3D培養システムは、正常および悪性の細胞を区別するために使用されており、適切な刺激^12,13与え、正常な表現型に形質転換された細胞の復帰を支援することが示されている。正しい組織構造も長距離にとって不可欠であることが示されている恒常性、アポトーシスの抑制、およびCID - 9乳腺上皮細胞の分化した表現型¹⁴のメンテナンス。細胞は、従来の単層培養¹⁵の3 - D構成としないで栽培された場合にのみ、マウスの多薬剤耐性は、EMT - 6乳癌細胞は 、in vitro で明らかにされることが示されている。これらおよび他のデータは^、16"高等生物の機能の単位がゲノムでも単独で細胞が、組織自体でもない"という提案につながっている。 3D回転楕円体を生成する他の多くの方法は、疑似微小重力のインキュベータ¹⁷とマイクロ成形、非粘着性ハイドロゲル^18,19の使用を含め、存在する。しかしこれらの方法とは異なり、ここで説明する方法はない特殊な装置や試薬を必要とせず、したがって、非常に費用対効果です。方法のシンプルさが潜在的な落とし穴を最小限に抑えることができます。そのため、学習曲線は比較的浅いですし、方法は、比較的短期間で容易に習得することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
automatic cell counter	Bio-Rad	TC10
shaking water bath with CO2 gable cover	Labline Instruments	3540