Summary
Ein effizientes Verfahren zur Oligomerisierung Neigung der Single-Pass-Transmembrandomänen (TMD) zu beurteilen ist beschrieben. Chimäre Proteine, bestehend aus dem TMD fusioniert ToxR sind in einer E. coli-Stamm-Reporter zum Ausdruck gebracht. TMD-induzierte Oligomerisierung Ursachen Dimerisierung von ToxR, Aktivierung der Transkription und Produktion von der Reporter-Proteins,-Galactosidase.
Abstract
Die vereinfachte Sicht von Protein Transmembrandomänen lediglich als Anker in Phospholipid-Doppelschichten ist längst widerlegt. In vielen Fällen membrandurchspannende Proteine hochentwickelten Wirkmechanismen entwickelt. 1-3 Ein Weg in die Membranproteine modulieren ihre Strukturen und Funktionen können durch direkten und konkreten Kontakt der hydrophoben Helices bilden strukturierte transmembrane Oligomere. 4,5 Großteil der jüngsten Arbeit über die Verteilung der Aminosäuren bevorzugt in der Membran-Umgebung im Vergleich zu wässrigen Lösung und die verschiedenen intermolekularen Kräfte, die Fahrt Protein-Assoziation. 6,7 Trotzdem Studien der molekularen Erkennung an der Transmembrandomäne von Proteinen immer noch hinter denen der Schwerpunkt gefunden wasserlöslichen Regionen. Eine große Hürde bleibt: Trotz der bemerkenswerten Spezifität und Affinität, die transmembrane Oligomerisierung erreichen können, 8 direkte Messung ihrer Vereinigung ist eine Herausforderung. Traditionelle Methoden angewendet, um das Studium integrale Membranprotein-Funktion kann durch die inhärenten Unlöslichkeit der Sequenzen unter Prüfung behindert werden. Biophysikalische Erkenntnisse aus dem Studium synthetischer Peptide, die Transmembrandomänen gewonnen werden können nützliche strukturelle Einsicht. Allerdings ist die biologische Relevanz des Waschmittels mizellaren oder Liposomen-Systeme in diesen Studien verwendet werden, um Zellmembranen imitieren oft in Frage gestellt; tun Peptide Annahme eines nativen Struktur unter diesen Bedingungen und hat ihre funktionale Verhalten wirklich die Wirkungsweise in einer nativen Membran ? Um die Wechselwirkungen von Transmembran-Sequenzen in natürlichen Phospholipid-Doppelschichten Studie entwickelten die Langosch Labor ToxR transkriptionelle Reporter-Assays. 9 Die Transmembrandomäne von Interesse, wie eines chimären Proteins mit Maltose-Bindungsprotein für die Lage auf dem Periplasma und ToxR ausgedrückt wird, um einen Bericht zu der Grad der Oligomerisierung (Abbildung 1).
In den letzten zehn Jahren mehrere andere Gruppen (zB Engelman, DeGrado, Shai) weiter optimiert und wandte diese ToxR Reporter-Assay. 10-13 Die verschiedenen ToxR Assays haben sich zu einem Goldstandard, um Protein-Protein-Interaktionen in Zellmembranen zu testen. Wir hier zeigen einen typischen experimentellen Betrieb in unserem Labor, die vor allem folgende Protokolle, die von Langosch entwickelt durchgeführt. Diese allgemein anwendbare Methode für die Analyse der Transmembrandomäne Selbstassoziation in E. sinnvoll coli, wo β-Galaktosidase Produktion verwendet werden, um die TMD Oligomerisierung Neigung zu beurteilen ist. Bei TMD-induzierte Dimerisierung bindet ToxR die ctx-Promotor verursacht up-Regulierung des LacZ Gen für β-Galactosidase. Eine kolorimetrische Ablesung wird durch Zugabe von ONPG zu lysierten Zellen erhalten. Hydrolytische Spaltung von ONPG von β-Galactosidase Ergebnisse in die Produktion von dem Licht absorbierenden Spezies o-nitrophenolat (ONP) (Abbildung 2).
Protocol
1. Cloning Überlegungen
- Kommerziell hergestellte Oligonukleotide, die die TMD von Interesse durch NheI und BamHI Restriktionsstellen und 5'-phosphorylierten flankiert können in pTox7 (modified in unserem Labor durch Insertion von einem Basenpaar direkt nach dem BamHI 14) (Abbildung 3) verdaut nacheinander ligiert werden mit BamHI und NheI. Ein Beispiel Oligonukleotid ist unten dargestellt:
5'ctagcTMDSEQUENCEg3 "
3 'gTMDSEQUENCEcctag5 "
Die TMD-Sequenz sollte 12-24 Rückstände (kürzere Sequenzen wird vermutlich durch den Vektor kodierten hydrophobe Reste verlängert werden). Um die Schnittstelle zu untersuchen, sollten vier Varianten des TMD-Design erstellt, wo sequenzielles Rest Insertionen und Deletionen gleichzeitige Rückstände Ergebnis in Rotation der TMD bezogen auf ToxR. 15,16 Schließlich wird die Arabinose-Konzentration zwischen 0,001 und 0,01% variiert werden sollten (w / v) zu Ermittlung der Konzentration, wo maximale Unterschiede in β-Galactosidase-Signale zwischen verschiedenen TMD Sequenzen beobachtet werden; Testen verschiedener Expression wird empfohlen, unter welchen Bedingungen unterschiedliche Affinitäten am besten unterschieden werden identifizieren können. Neben Arabinose und Antibiotika, können 0,4 mM IPTG verwendet werden, um Unterschiede in der Affinität zwischen verschiedenen TMDs zu verbessern. Die ToxR Messung sollten mindestens in vierfacher Ausfertigung durchgeführt werden. Der ganze Vorgang sollte mindestens dreimal mit verschiedenen Plasmid-Transformationen wiederholt werden.
2. Das Wachstum von Bakterienkulturen
- Vorsichtig auftauen FHK12 kompetente Zellen (200 ul) auf Eis und Überführung in eine 15 ml Kultur Röhre. Add Plasmid-DNA (200 ng) und inkubieren Sie die Zellen auf Eis für 30 min.
- Hitze-Schock-Zellen durch Inkubation für 90 s bei 42 ° C, durch Inkubation auf Eis für 2 min folgte.
- Add SOC Media (800 ul) und inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C unter Schütteln (300 rpm) für eine h.
- Impfen 5 ml LB-Medium mit Chloramphenicol (30 ug / ml) und Arabinose (0,0025% w / v) mit 50 ul der Transformation Mischung in 15 ml Kulturröhrchen in dreifacher Ausfertigung. Inkubieren Proben bei 37 ° C unter Schütteln (300 rpm) für 20 h. (Alternativ 5 ul der Kultur kann zu 100 ul Medium in einer 96-Well-Platte zu impfen. Diese Methode ist nützlich, wenn es mit einer großen Anzahl von Proben, obwohl Fehler wird etwas höher sein. Um die Verdunstung, die führen würde vermeiden um Fehler, füllen Sie die äußersten Brunnen mit Medien, sondern verwenden sie nicht für die Proben. Schließlich, Doppel-wrap die Verbindung zwischen dem Deckel und die Platte mit Parafilm).
3. Die Messung der β-Galactosidase-Aktivität
- Heizen Sie den Platten-Leser bis 28 ° C.
- Übertragen Sie die Z-Buffer in ein Reservoir mit einem großen Pipettenspitze, achten Sie darauf, nehmen nur die obere (wässrige Schicht). Transfer 100 ul frisch zubereitet Z-buffer/chloroform in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Transfer-5 ul jeder Kultur in die Vertiefungen der Platte in vierfacher Ausfertigung. Lassen Sie die Kultur von vier Brunnen, die als leere dienen wird.
- Messen Sie die OD 595 von der Platte auf die Zelldichte zu bestimmen.
- Add 50 ul Z-buffer/SDS in alle Vertiefungen der Platte. Schütteln Sie die Platte in der Platte-Reader für 10 min auf die Zellen zu lysieren. Sicherstellen, dass die Zell-Suspensionen sind nach der Lyse klar und wiederholen das Schütteln Schritt, wenn erforderlich. Unvollständige Lyse schlägt die Z-buffer/chloroform nicht frisch zubereitet.
- Dann werden 50 ul frisch zubereiteten Z-buffer/ONPG in alle Vertiefungen und kehren die Platte auf die Platte Leser und messen OD 405 alle 30 s für 20 min.
- Berechnen Sie β-Galactosidase-Aktivität mit der folgenden Gleichung (wir erinnern uns, um die leeren subtrahieren). Das Verhältnis von OD 405 / min sollte anhand aller Datenpunkte in der OD 405 Bereich von 0,0 bis 1,0 unter Verwendung eines linearen Modells angepasst werden.
Miller Einheiten unterscheiden sich manchmal, wenn an verschiedenen Tagen aufgenommen. Deshalb sollte eine Referenz zu konstruieren, wie GpA in jeder Prüfung zu messen. Die Werte können für die Normalisierung der ToxR Werte verwendet werden.
4. Steuerung für die Proteinexpression
- Führen Western-Blot, auch Protein-Expression von Konstrukten zu überprüfen. Kombinieren Sie 50 ul des dreifachen Kulturen und Zentrifuge (2000 rpm, 4 min) in einer Mikrozentrifuge. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette resuspendieren und die verbleibende Pellet in 2 x Probe Ladepuffer.
- Last 7,5 ul auf einem Standard 8% Gel und Durchführung Elektrophorese bei 125 V für 1 Stunde 5 min. Nach der Übertragung mit anti-MBP HRP-konjugierten Antikörper inkubiert und zu visualisieren, die chimäre Protein ist bei ca. 70 kDa mit einigen Abbauprodukte manchmal um 48 kDa zu sehen beobachtet. Endogene MBP ist auch bei 45 kDa beobachtet (siehe Abbildung 5).
5. Control für Proper Membraninsertion
Eine Zelllinie Mangel an Maltose bindendes Protein verwendet wird, um eine ordnungsgemäße Membraninsertion des chimären TMD konstruieren zu beurteilen. Wenn auf Minimalmedium mit Maltose gewachsen als alleinige Kohlenstoff-Quelle, Ausdruck nur Zellen eine Membran-Integral-Ausdruck Produkt mit Maltose-Bindungsprotein richtig in das Periplasma befindet sind in der Lage zu wachsen.
- Transform PD28-Zellen (wie bei FHK12 Zellen beschrieben) und impfen 2 ml LB-Medium. Wachsen die Zellen bei 37 ° C unter Schütteln (300 rpm) über Nacht.
- Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 3500 rpm, 10 min, 4 ° C und Waschen durch Resuspendieren in PBS (2 ml) durch vorsichtiges Pipettieren mit einer großen Spitze oder sanfte Vortexen. Pellet den Zellen (wie oben), mit PBS waschen ein zweites Mal, Pellet-und schließlich in PBS (1 ml) resuspendieren.
- Verwenden Sie 25 ul der resuspendierten Zellen in 5 ml Minimalmedium in dreifacher Ausfertigung und bei 37 zu impfen ° C unter Schütteln (300 rpm). Nehmen OD 595 Lesungen zwischen 15-25 h, ca. alle 2 Stunden durch die Übertragung von 200 ul von jeder Probe in eine 96-Well-Platte und das Lesen mit dem Platten-Leser.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Ein Beispiel für die Verwendung des ToxR transkriptionelle Reporter-Assay auf die Oligomerisierung Neigung von Transmembrandomänen in Abbildung 4 zu analysieren. Bisher haben wir die Oligomerisierung von Transmembrandomänen von untersuchten die multispanning Membran-Integral-Protein latent membrane protein-1 (LMP-1) durch verschiedene Techniken, darunter ToxR 14 Transmembrandomäne fünf (TM5) wurde gezeigt, dass eine starke Neigung zur Oligomerisierung aufweisen.; Diese zeichnet sich durch hohe Miller Units, vergleichbar mit der positiven Kontrolle, GPA, eine gut etablierte Dimerisierung Sequenz gezeigt. Eine Mutation in TM5, D150A, reduziert die Fähigkeit der Sequenz oligomerisieren. LMP-1 TM1 nicht wesentlich oligomerisieren und weist einen sehr niedrigen Miller Einheit Signal, gerade über das Signal für leere, nicht-transformierten Zellen FHK12.
Abbildung 1. Cartoon Darstellung der ToxR Reporter-Assay. Transmembrandomäne (TMD) angetrieben Oligomerisierung Ergebnisse in Dimerisierung von ToxR und Aktivierung von LacZ Transkription. Das Genprodukt von LacZ, können β-Galactosidase als Maß für die Neigung einer TMD zu oligomerisieren quantifiziert werden.
Abbildung 2. Die hydrolytische Spaltung von ONPG von β-Galactosidase Ergebnisse in die Produktion von dem Licht absorbierenden Spezies o-nitrophenolat (ONP).
Abbildung 3. Plasmidkarte von pToxR7.
Abbildung 4. Representative ToxR transkriptionelle Reporter-Assay Analyse der Oligomerisierung Neigung der latent membrane protein-1 Transmembrandomänen. Transmembrandomäne 5 (TM5) oligomerisiert stark, während Transmembrandomäne 1 (TM1) zeigt nur eine schwache Wechselwirkung. Mutation D150A in TM5 reduziert seine Fähigkeit zur Oligomerisierung. GPA ist als eine positive Kontrolle Sequenz für starke Dimerisierung enthalten. Blank stellt transformierten FHK12 Zellen.
Abbildung 5. Western Blot für die Proteinexpression.
Abbildung 6. PD28 Komplementation Test auf korrekte Membraninsertion in das Periplasma zu kontrollieren. Negative Kontrolle stellt ein Konstrukt Mangel an Maltose bindendes Protein.
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Discussion
Die ToxR transkriptionelle Reporter-Assay ist eine einfache Möglichkeit, transmembrane Sequenzen mit dem Potenzial, oligomerisieren identifizieren. Da die Wechselwirkungen innerhalb der bakteriellen inneren Membran stattfindet, umgeht diesen Test die Probleme mit der Gültigkeit der Untersuchung von Systemen in Membran-Mimetikum-Umgebungen. Da das Klonen von mehreren TMDs in einem einzigen Plasmid leicht können parallel ausgeführt werden und der gesamte Test kann in 96-Well-Platte-Format durchgeführt werden, kann dieser Test für hohen Durchsatz-Analyse einer großen Zahl von Protein-Sequenzen verwendet werden. 17 Sobald ein Interaktion erkannt wurde, kann der Schlüssel funktionellen Reste von Mutationsanalyse abgefragt werden, so dass Abbildung der strukturellen Merkmale beteiligt. In vielen Fällen ist kristallographische Analyse der Transmembranproteine problematisch und erfordert alternative Instrumente wie die ToxR Assay auf die molekularen Grundlagen der Funktion zu etablieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken den National Institutes of Health (1R21CA138373 und Stand Up to Cancer (SU2C) für die finanzielle Unterstützung dieser Arbeit. HY ist dankbar für das Geschäftsjahr 2009 Elion Award von der American Association of Cancer Research, ein Kimmel Scholar Award der Sidney Kimmel Stiftung für Cancer Research (SKF-08 bis 101) und der National Science Foundation Fakultät Early Career Award (NSF0954819).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI restriction enzyme | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| NheI restriction enzyme | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| 15 mL culture tubes | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC media | TEKnova, Inc. | S0225 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| LB media | Sigma-Aldrich | L7275 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO378 | Stock solution of 30 mg/ mL in ethanol stored in freezer |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stock solution of 2.5% (w/v) in water stored in freezer |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6858-06 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na2HPO4 5.5g NaH2PO4 0.75g KCl 0.246g MgSO4 Make up to 1 l, pH 7.0 |
||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercapt–thanol, 2 mL chloroform, make up to 20 mL with Z-buffer. Vortex for 1 min, centrifuge for 1 min at 800 rpm. Make fresh for each plate. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS dissolved in 10 mL Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-buffer. Make fresh for each plate | ||
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoclonal antibody (HRP conjugated) | New England Biolabs | E8038S | |
| Minimal media with maltose | 1 x M9 salts, 0.4% maltose, 1 mg/ mL thiamin, 2 mM MgSO4 | ||
| 96-well flat bottom plate | Sarstedt Ltd | 83.1835.300 | |
| Plate-reader | Beckman Coulter Inc. | DTX880 Multimode Detector | |
| Water bath | VWR international | 89032-204 | |
| Shaking incubator | Forma Scientific |
References
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