Summary
Geconserveerde insuline signaalwegen te vinden in de fruitvlieg
Abstract
Geconserveerde voedingsstoffen sensing mechanismen bestaan tussen zoogdier en de fruitvlieg, waar peptiden die lijken op zoogdieren insuline en glucagon, respectievelijk de functie om glucose homeostase te handhaven tijdens ontwikkeling larvale stadia 1,2. Studies over grotendeels post-mitotische volwassen vliegen hebben aangetoond verstoring van de glucose homeostase als gevolg van genetische ablatie van insuline-achtige peptide (ILP) producerende cellen (IPC's) 3. Zo volwassen fruitvliegjes zijn veelbelovend als een geschikt modelsysteem voor genetisch metabole aandoeningen, waaronder type II diabetes. Verdere ontwikkeling van de fruitvlieg-systeem, dient men over vergelijkbare fysiologische testen gebruikt om de glucose tolerantie en de gevoeligheid voor insuline bij zoogdieren te meten worden vastgesteld. Daartoe hebben we onlangs beschreven een nieuwe procedure voor het meten van orale glucose tolerantie respons in de volwassen vliegen en het belang aangetoond van volwassen IPC's bij het handhaven van glucose-homeostase 4,5. Hier hebben we aangepast van een eerder beschreven procedure voor de insuline-injectie 6 en gecombineerd met een nieuwe hemolymfe extractie methode om perifere insuline gevoeligheid te meten in de volwassen vlieg. Uniek is dat ons protocol maakt een directe fysiologische metingen van het vermogen van de volwassen vlieg te beschikken over een perifere glucose-belasting op insuline-injectie, een methodiek die maakt het mogelijk om insuline signalering mutanten en de mogelijke interventies die de glucosetolerantie en insulinegevoeligheid in de volwassen vlieg karakteriseren.
Protocol
1. Insuline bereiding van oplossingen
- Bereid vers vlees van runderen insuline-oplossing door het oplossen van insuline in PBS met de concentratie van 0,01 mg / ml te bereiken. Zowel insuline / PBS en controle PBS oplossingen moeten worden bewaard op ijs gedurende de injectie procedure. Deze oplossingen moeten worden bereid met 0,5% (v / v) FD & C Blue geen. Een kleurstof.
2. Naald Voorbereiding en injectie Set-up
- Bereid capillaire glazen naalden met behulp van een micropipet puller.The volgende puller instellingen produceren naalden van voldoende kwaliteit voor injectie: Heat, 345, Pull, 210, Velocity, 100, Time, 200 (100ms). Vers getapt naalden moeten worden tegengewerkt door het indrukken van de tip via een Kimwipe weefsel. Deze afstomping proces verwijdert de langgerekte hoge weerstand tip en produceert een stouter tip met een grotere poriën diameter.
- Plaats blunted naalden tip-up in een microcentrifugebuis met de insuline / PBS-oplossing of PBS alleen. Capillaire werking resulteert in een back-vulling van elke naald. Let op de punt van de naald onder een stereomicroscoop om ervoor te zorgen dat er geen vuil of luchtbellen verschijnen aan het uiteinde. Gooi naalden die niet netjes te vullen.
- Plaats de gevulde naalden in de handleiding microinjector naaldhouder en de positie van de naald houder met een micromanipulator, zodat de naald is zichtbaar door een stereomicroscoop. Van toepassing zijn positieve druk op de vloeistof kolom in de naald door het draaien van de handleiding microinjector micrometer knop aan de zuiger op de microinjector spuit.
- Controleer of er voldoende druk voor vloeistoffen is toegepast door het aanraken van een Kimwipe aan het uiteinde van de naald en bevestigen vloeistofstroom.
- Zodra de naald is voorbereid voor injectie, een kalibratie grafiek aanbrengen om de naald as met heldere tape, en breng de naald in beeld door middel van een stereomicroscoop onder een vergroting van 20x.
3. Fly Voorbereiding
- Tien dagen oude vrouwtjes worden gebruikt voor injectie experimenten. Verzamel vliegt binnen de 24 uur van Eclosion. Verdoven vliegt met bevochtigde CO 2 op een gas-pad, een soort uit mannetjes en vrouwtjes plaats in flesjes met standaard of behandeling dieet. Onderhouden vrouwtjes over experimentele diëten voor 10 dagen.
- Op de tiende dag na Eclosion en scheiding op experimentele diëten, transfer vliegt van hun voedsel-bevattende flacons dat flacons met een 5 ml stekker van 2% agar en verhongeren ze voor 12-16 uur
- Overdracht uitgehongerd vliegt naar flacons met 10% glucose geweekt filters gedurende 1 uur voorafgaand aan de insuline-injectie.
- Kort verdoven de vliegen met bevochtigde CO 2 na glucose voeden en vervolgens koud te immobiliseren op ijs.
4. Injectie Procedure
- Voorzichtig greep een koude-geïmmobiliseerde vliegen met een paar fijne pincetten en houd het dicht bij de naald, zodat de tip grenst aan het voorste deel van de linkerkant van de thorax van de vlieg. Breng zowel de naald en de vlieg thorax in beeld onder de stereomicroscoop.
- Beweeg de vlieg in de richting van de naald, zodat de naald raakt het midden van de uitstulping van de linker prescutum gebied van de thorax van de vlieg (afb. 1). Zodra de vlieg in de juiste richting en in lijn met de naald tip, blijven de vlieg op de naald, zodat de naald het midden van de prescutum doorboort vooraf.
- Van toepassing zijn positieve druk indien nodig door het bevorderen van de zuiger met micromanipulator van de microinjector de knop tot 0,1 pi van vloeistof is geïnjecteerd in de vlieg. De stroom van vocht in hemocoel de vlieg zal geven een blauwe kleur aan de linkerkant van de voorste thorax. Af en toe moet men intrekken en vooraf een paar keer op een punt van de naald verstopping los en voor de vloeistofstroom mogelijk te maken.
- Laat geïnjecteerd vliegt in 2% agar flesjes terug voor aangewezen tijdstippen voor hemolymfe extractie.
5. Hemolymfe Collection
- Kort verdoven vliegt met bevochtigde CO 2 op de gewenste post-injectie tijd punten en positie elke fly rug-side-down op dubbelzijdig tape aangebracht op het oppervlak van een CO 2 pad. Schik vliegt zelfs in rijen met uitgelijnd hoofd capsules. Men kan gebruik maken van een bijgesneden houten applicator vasthouden aan hun vleugels druk in de tape lijm en immobilisatie te verzekeren.
- Zodra vliegen zijn bevestigd aan de band, pakt elke vlieg proboscis met fijn pincet en trek het voorzichtig naar de ventrale en dan achterste deel van de vlieg, zodat de voorkant van het hoofd capsule is zichtbaar door de stereo microscoop.
- Met uw andere hand en terwijl de proboscis in positie, doorprikken het midden van het hoofd capsule net boven de ptilinal hechtdraad met een scherp wolfraam naald (afb. 2). Men moet oppassen niet om de naald te ver omdat het gemakkelijk is om de punt van de naald punch via de andere kant van het hoofd capsule en vervolgens te verliezen cONTROLE van hemolymfe flow. Punctie vliegt alles in een injectie groep voor het verzamelen van hemolymfe.
- Zodra het hoofd capsule heeft aangeprikt, gebruik dan een bijgesneden houten stok applicator voorzichtig druk uit te oefenen op de buik van de vlieg. Het kan nuttig zijn om het viaduct, zodat het rust op zijn buikzijde als u druk uitoefenen roll. Deze procedure zal een druppel van hemolymfe van het hoofd capsule prikplaats.
- Raak het ene uiteinde van een 1μl microcapillaire buis aan de hemolymfe druppel die uit het hoofd capsule prikplaats. De hemolymfe zal in de buis via capillaire werking. Bepaal en noteer de hoeveelheid hemolymfe verzameld door het controleren van de vloeistof kolom binnen de microcapillaire buis tegen een afgestudeerd volume grafiek.
6. Hemolymfe Glucose Bepaling
- Eject hemolymfe monsters in microtiterplaat putjes die 100 ul van Infinity Glucose reagens. Houd plaat op ijs tijdens het laden van hemolymfe monsters.
- Stel een standaard curve door het laden van een afzonderlijk ui elk van glucose voorraad oplossingen op 50mm, 25mm, 12,5 mm, 6.25mM en 3.125mM.
- Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Detect absorptie bij 340 nm.
- Account voor hemolymfe volume verzameld en te bepalen steekproef glucose concentratie op basis van de standaard curve met bekende glucose concentraties.
7. Representatieve resultaten
Een typische reactie van insuline tolerantie wordt gedetecteerd in insuline-injectie vliegt, waar een daling van het circulerende glucose wordt gedetecteerd 15 minuten na de injectie. In tegenstelling, is een dergelijke reactie niet gezien in PBS geïnjecteerd vliegt (afb. 3). Deze reactie in de afvoer van perifere glucose blijft in het insuline-injectie vliegt tot 30 minuten na de injectie. We routinematig extract 0,2-0,5 pi hemolymfe per 4-5 vliegt in elke injectie groep. Drie injectie groepen worden opgenomen in elk experiment.
Figuur 1. Linkerkant van Drosophila thorax met naald inbrengen site (Aangepast uit Demerec, 1950) 7. Steek de naald door het midden van de prescutum op de voorste, rug-regio van de linker zijde van de thorax.
Figuur 2. Vooraanzicht van Drosophila hoofd zien punctie plaats voor hemolymfe extractie (Aangepast uit Demerec, 1950) 7. Prik de kop capsule met een fijn geslepen wolfraam sonde in het midden van het hoofd capsule net boven het ptilinal hechtdraad.
Figuur 3. Een typische reactie van insuline tolerantie waargenomen in de controle volwassen vliegen. Controle w 1118 vliegt werden geïnjecteerd met insuline van runderen (1 ng in PBS) of PBS alleen. Vliegen in repliceren groepen werden vervolgens toegestaan om te herstellen voor 0, 15 of 30 minuten en circulerende glucose niveaus werden gemeten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De techniek wordt beschreven in dit rapport is potentieel bruikbaar in een studie dat fysiologische processen resulteert in aantoonbare veranderingen in Drosophila hemolymfe samenstelling onderzoekt. Door het combineren van injectie en hemolymfe collectie op deze manier, is het mogelijk om vast te stellen de directe fysiologisch relevante effecten van een bepaalde experimentele behandeling of manipulatie. Het voornaamste voordeel van deze "bloedvergieten" techniek in hemolymfe collectie ten opzichte van eerdere technieken met onthoofding 2 is dat deze techniek contaminatie van hemolymfe monsters minimaliseert met darm contents.If zorg is genomen om geen pericerebral vet lichaamsweefsel, die soms kunnen voorkomen in de te verzamelen straalde hemolymfe druppel, vervolgens monsters moeten nauwkeurig de toestand van de in vivo bloedsomloop vloeistoffen.
Een potentieel storende factor inherent zijn aan elke injectie experiment uitgevoerd op deze schaal is de eerste verdunning van de totale bloedsomloop vloeistoffen na de injectie. Dit kan gemakkelijk worden gecontroleerd voor, maar door injectie van hetzelfde volume van PBS in experimentele vliegt of insuline in de leeftijd gematchte controles en het normaliseren van de resultaten. Om tot reproduceerbare circulerende glucose metingen, de kwaliteit van de hemolymfe druppels is het van het grootste belang. Alleen heldere druppels hemolymfe zonder pericerebral dik lichaam of ander weefsel afval moet worden verzameld voor glucose bepalen. Het is ook opmerkelijk dat slechts tot acht monsters moeten worden verzameld voor het bepalen van de relatieve glucose concentraties. We merkten een "drift" in OD 340 metingen bij de hemolymfe monsters werden achtergelaten op het ijs voor een langere periode van tijd.
Ons protocol laat veel ruimte voor aanpassing op basis van beschikbare apparatuur. Pipet trekker instellingen moet mogelijk worden aangepast op basis van het model en de conditie van de trekker. Wij hebben geconstateerd dat instellingen voldoende voor de productie van intracellulaire registratie-elektrode naalden zijn ideaal voor injectienaalden. Bovendien, terwijl we gebruik van een drie-assige micromanipulator voor het behoud van de naald positie onder de stereoscoop, kan dit ook worden bereikt met een stevige ringstand en klem systeem als de naald blijft in een vaste positie gedurende de injectie procedure. De hoge weerstand van de gebruikte naalden noodzakelijk voor de ontwikkeling van een alternatieve methode voor het bepalen van het volume van de ingespoten vloeistof als een 1:1 zuiger beweging om het volume verplaatsing niet haalbaar was. We ontwikkelden een schaalverdeling die kunnen worden afgedrukt en aan de zijkant van de naald as. Afhankelijk van het gebruikte systeem, kan het zo nodig zijn om wat vocht te verdringen van de naald voorbij de naald houder van het microinjector dat de vloeistof meniscus kan worden uitgelijnd met graduaties de calibratie-kaart aangebracht op de zijkant van de naald as.
Tot slot zijn twee beperkingen van deze techniek vermeld in ons protocol. Eerst worden twee personen meestal verplicht om zowel de injectie en extractie hemolymfe stappen te coördineren om het aantal verwerkte samples te maximaliseren. Ten tweede, zijn variaties in de insuline tolerantie soms zijn waargenomen binnen hetzelfde genotype. Wij geloven dat dit te wijten is aan een variabele reacties individuele vliegt misschien hebben de volgende ijs immobilisatie en herstel op agar. Daarom moet een voldoende aantal monsters worden onderzocht voordat betrouwbare conclusies kunnen worden getrokken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIA naar YW.CF (AG21068, AG31086).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine insulin | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Infinity Glucose Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TR1541 | |
| Manual microinjector | Sutter Instrument Co. | ||
| P-87 Flamming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Single barrel borosilicate capillary glass | A-M Systems | 626000 | |
| FD&C Blue No. 1 | McCormick & Co. | ||
| 1 μl microcapillary tubes | Drummond Scientific | ||
| Three-axis manual micromanipulator and base | World Precision Instruments, Inc. |
References
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1118 (2002).
- Kim, S. K., Rulifson, E. J. Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells. Nature. 431, 316-316 (2004).
- Broughton, S. J. Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).
- Haselton, A. Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance. Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).
- Haselton, A. T., Fridell, Y. W. Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis. Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).
- Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila. J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).
