Pressurization אימפולסיבית של תאים עצביים לחקר פגיעה מוחית טראומטי

Summary

ניסוי pressurization רומן אימפולסיבי תא פותח באמצעות מכשיר בר Kolsky לחקור את המנגנונים מולקולריים / סלולריים של פגיעה בפיצוץ גרם מוח הטראומתית.

Abstract

ניסוי pressurization רומן אימפולסיבי תא פותח באמצעות מכשיר בר Kolsky לחקור פגיעה מוחית טראומטית פיצוץ מושרה (TBI). אנו מראים במאמר זה וידאו איך pressurization אימפולסיבית TBI-רלוונטי הפיצוץ מוחל על תאי העצב במבחנה. זו מושגת על ידי שימוש בדופק לחץ מבוקר היטב שנוצר על ידי מכשיר בר Kolsky מיוחד, עם היסטוריה של לחץ מלאה בתוך התא על לחץ התא המוקלט. תאים עצביים לחץ נבדקים מייד לאחר pressurization, או יותר מודגרות לבחון את ההשפעות ארוכות הטווח של לחץ קבוע על אימפולסיבית תולדה neurite / אקסונלית, ביטוי גנים עצבי, אפופטוזיס, וכו 'אנחנו נצפינו שpressurization אימפולסיבית בסביבות 2 מגפ"ס גורם יחסי אובדן neurite מובחן לתאים ללא לחץ. הטכניקה שלנו מספקת שיטה חדשה לחקור את המנגנונים מולקולריים / סלולריים של פיצוץ TBI, דרך pressurization אימפולסיבית של תאי מוח ביחסי הציבור מבוקרים היטבessure עצמה ומשך זמן.

Protocol

1. תא תרבות עצבית

1. תאי מוח בין תאי עצב, האסטרוציטים, ושיתוף תרבותם עשויים לשמש כמודל לתא. כהדגמת היתכנות, pressurization אימפולסיבית של תאים עצביים תא השורה מוצג.
2. תאי neuroblastoma אדם SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) שנמצאים בתרבית על coverslips זכוכית בקוטר 18 מ"מ. תאי הזרע בצפיפות של 3 × 10 ³ תאים / ² סנטימטר באמצעות תקשורת הצמיחה המורכבת מDMEM בתוספת סרום 10% שור עוברי ו1% פניצילין סטרפטומיצין. שקופיות זכוכית תרבית תאים נשמרות בCO ₂ חממה 5% humidified ב 37 ° C.
3. כדי להשיג את התמיינות התאים העצבית של תאי SH-SY5Y, תאים שטופלו באמצעי תקשורת נוספת עם תוספת חומצה רטינואית מיקרומטר 10 (ע"ר) למשך 7 ימים עם תקשורת השתנה בכל ימים. ביום 7, תאים מוכנים להיות בלחץ.

2. ציוד לחץ קבוע: Kolsky בר

1. בר Kolsky, דהveloped על ידי ¹ Kolsky בשנת 1949, נעשה שימוש כדי למדוד את המאפיין המכאני של חומר בקצב טעינה גבוהה מאוד. המנגנון מורכב משני ברים עם מדגם דגש על קשר בין הסורגים. גל לחץ, יצר בשורת האירוע, מתפשט לדוגמא שבו הגל מתפצל לגל משתקף ומשודר. המתח במדגם פרופורציונלי לגל המשודר. במחקר זה, אנו מנצלים קאמריים pressurization תא כדי להיות ממוקם בין שתי חפיסות Kolsky הגדרה.
2. שני ברי מסגסוגת האלומיניום (כל 6-מ 'אורך) מושעים על ידי מסבי נחושת מיושרת, ובתא לחץ קבוע תא מבחנה היא דחוק בין הסורגים. בר מעלה הזרם הוא בשורת התקרית עם מסת £ 130 נצמדה אל קצה אחד. מהדק חיכוך ממוקם במקום כזה שייתן את משך הדופק הרצוי. על ידי העוסק במהדק והידוק שקע מספריים בין המסה ותמיכת טעינה, סעיף מהדק המסה של בר האירוע הוא ג מראשompressed לרמה הרצויה. מכריח את בורג מחורצים הנועל את התפס להפסקה פתאומית במערכת הידראולית משחרר דחיסה מראש מאוחסנת במהירות ובכך יוצר לחץ דופק. זה מתפשט דרך סרגל האירוע, כונני הבוכנה הקאמרית הבדיקה, וpressurizes הנוזל ותאים בתוך התא אימפולסיבית. על הלחץ הקאמרי בתור יוזם דופק לחץ מתפשט במורד הבר המשודר. המתחים הקשורים בפולסים הלחץ בברים נמדדים במדדים מתחמים גבוהים התנגדות מתח נרגשים עד 45 וולט. אותות המד נרשמים עם אוסצילוסקופ דיגיטלי בתדר MHz 1 כהיסטורית טעינה.
3. בתא על לחץ תא מבחנה מורכבת מבוכנת צילינדרים. הצילינדר יש קוטר 2.6 סנטימטר וסנטימטר קוטר פנימי 3.8 חיצוני, ויש לו חור קטן טפח בבסיס של החלל. החור משמש כאוויר ואוורור נוזלים עודף במהלך התקנת מדגם תא. הבוכנה ארוכה 7.5 סנטימטריםוהוא עשוי מאותו חומר בר. הבוכנה היא עטופה עם שתיים או שלוש שכבות של הקלטת של השרברב (טפלון), המשמשות כחותם חיכוך נמוך. הכובע הסופי הוא 32 מ"מ ארוך ויש לו שני ברגי נירוסטה קטנות שמהדקים את coverslips הזכוכית (שבתאים בתרבית) במהלך הטעינה.

3. Pressurization אימפולסיבית של תאים עצביים

1. כל החלקים הקאמריים pressurization מעוקרים באמצעות החיטוי ונשמרים תחת אור UV. ההרכבה של התא מתבצעת בתוך מכסה מנוע תרבית התאים. בורג האוורור בתא עוסק באופן רופף בפתח האוורור בבסיס של החלל. טרום התחמם (37 ° C) תקשורת צמיחה הטריה pipetted לתוך התא בלי בועות. ואז, שקופית זכוכית תא תרבותית היא הרים, וממוקמת על המכסה של הבוכנה (תאים פונים החוצה). הברגים שהחזיקו קטנים הדקו למטה על השקופית כדי להחזיקו במקום. הבוכנה עם שקופית זכוכית תא תרבותית מוכנסת מעט אניn בחלל של החדר, וההרכבה מוטה עם האוורור להיות בנקודה הגבוהה ביותר. בורג האוורור מוסר והבוכנה דחפה לתוך החלל מאלץ את הראשון בועות אוויר, ואז נוזלים העודפים. כך או סימון הפניה או לנענע משמש כמדריך על מנת להבטיח את אותו נפח תקשורת התרבות לכל מבחן. הממד הצירי של התקשורת בחדר הוא כ 6 מ"מ. לטהר את בורג האוורור ולהחליף אותו כדי להפוך את המים הקאמריים הדוק. הקאמרי לא צריך לדלוף תחת עומס סטטי זו, אם כן, הטפלון לעטוף צריך להיות מוחלף או מחוזק.
2. בשלב זה, מערכת בר Kolsky מתאפסת. המסה הכבדה תועבר חזרה למיקום המקורי ובורג נעילה חדשה מחליף את שימוש (שבור). לעסוק בורג הנעילה החדש עם הידראוליקה לכ 200 psi. השתמש במספרי השקע כדי לדחוס את חלק הטעינה מראש של בר האירוע ללחץ קצת יותר גבוה מהערך הרצוי, ולאחר מכן לגבות אותו לעסוק חיכוך מלאבורגו של ג'ק. רכישת הנתונים כעת חמושה.
3. הקאמרי pressurization התא התאסף הוא רכוב לתוך המערכת. הוא ממוקם בבלוק V הנתמך על ידי מעבדת שקע מספריים קטן ומיושר עם שני הפסים. משמנים כל ממשק עם שכבת גריז אור ולשפשף את המשטחים הנדחפים יחד כדי לחסל את כל מרווחי אוויר שביניהם.
4. המבחן עכשיו הוא מוכן להמשיך. בורג נעילת המהדק הוא נאלץ לשבור על ידי שאיבת נהג המהדק ההידראולי במהירות. המהדק יפריד ורכישת הנתונים צריכה להציג את התוצאות. היסטורית pressurization התא נקבעה מהמדידות של המד הבר המשודר. אם הבר מועבר משמש הוא מספיק זמן, זה אמור להיות רק מההפרעה הראשונה שהנקודה שבה המדידות מראות לחץ שלילי. משך הדופק מועבר עשוי להיות קצר יותר מדופק האירוע אם בועה היא לכוד. הגודל לא יכול להגיע לזה של דופק האירוע, אבל זה צריך להיות מספיק לוןגרם מישור לפני הפריקה. אחרת, או בועת אוויר גדולה בתא האטום או חוסר תיאום בין ההרכבה וברה אולי התרחשה.
5. אז קאמרי pressurization התא מוסר ומפורק בתוך ברדס תרבות התא. בורג האוורור מוסר והבוכנה נחלצה מהתא. שקופית זכוכית תא התרבותית נלקחת מהקצה של הבוכנה.

4. הערכת התנהגות תא לחץ

1. לאחר על לחץ, התאים ניתן יהיו לבדוק באופן מיידי או מודגרות נוסף לבדיקה מאוחר יותר. עם תהליכי תפעול אספטיים נאותים, לטווח ארוך לאחר הדגירה אפשרית.
2. תאי לחץ יכולים לבדוק את כל טכניקות הביולוגיה המולקולריות ותאיות. באופן ספציפי לתא על לחץ עצבי, כדי לחקור את הפיסיולוגיה התאית ומולקולרית בתנאי TBI, מבחני הערכת שינויים בלחץ מושרה בתולדת neurite, שינוי microtubule cytoskeletal, expre גן העצביssion, אפופטוזיס, וכו ', ניתן לבצע. כדגימות בקרה סלולרית, תאים שהם בתרבית באותו זמן, בתוך חדר pressurization לאותה תקופת זמן, אבל לא בלחץ משמשים (מה שנקרא, חדר בקרה).
3. להערכת השינויים בתולדת neurite, תאי בקרת לחץ וקאמריים נבחנים על ידי מיקרוסקופ אופטי מייד לאחר pressurization וh 1 ו 24 שלאחר הדגירה. דוגמה לתמונות תא עצביות מוצגת בחלק 'נציג התוצאות' (איור 2). שינוי האורך neurite ניתן לכמת מכתים immunofluorescent יקטין וניתוח תמונה. תאים קבועים עם 4% פתרון w / v paraformaldehyde, נשטף עם 0.05% חיץ v / v Tween-20 רחצה, וpermeabilized עם 0.1% X-100 פתרון v / v טריטון. לאחר חסימה עם 1% פתרון w / v שור אלבומין, תאים מודגרת עם isothiocyanate tetramethylrhodamine (TRITC)-מצומדות phalloidin. תמונות Immunofluorescent של התאים נלקחות באמצעות ניאוןמיקרוסקופ ואורכי neurites לתאים דחוסים ובקרה לכמת באמצעות ImageJ התוכנה (NIH).
4. את neurites יכול להיות מזוהה כאקסונים או דנדריטים. על מנת להעריך את השינויים מורפולוגיים באקסונים או דנדריטים, הניסויים שתוארו לעיל ניתן לחזור באמצעות נוגדני גילוי כל מבנה, כלומר, neurofilament נוגדן (NF) לאקסונים וחלבון נוגדני microtubule המשויך (MAP2) לדנדריטים.
5. Microtubules הוא אחד ממרכיבי המפתח של cytoskeletal נוירונים, והניזק לmicrotubules שמש כסמן של פגיעה עצבית. ² microtubule ניתן דמיין immunofluorescently באמצעות נוגדני β-טובולין. תאים הם קבועים לאחר שעות 0 ו 24 של פוסט על לחץ, מוכתמים בנוגדן β-טובולין, ונצפו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
6. כדי להעריך את ההשפעה על לחץ אימפולסיבית על ביטוי גנים עצבי ואפופטוטיים, הסך RNA מופק מתאי לחץ ושליטה. Genביטוי דואר ניתן לבדוק על ידי ביצוע כמותית RT-PCR או בזמן אמת RT-PCR, בדומה לפרוטוקולים שפורסמו. ³

5. נציג תוצאות:

איור 1. דוגמה של פרופיל לחץ מוחל על התאים בתוך תא לחץ הקבוע. מנגנון בר Kolsky יוצר הצלחת רמת מגפ"ס 2, pressurization אימפולסיבית הסוג יחיד דופק עם משך זמן של כ -0.7 אלפיות שני.

איור 2. דוגמה של תגובה עצבית לתא על לחץ אימפולסיבית. תאי SH-SY5Y חשוף ללחץ קבוע אימפולסיבית בהתמוטטות 2 מגפ"ס תכנית ברורה neurite / האקסון יחסית לתאי בקרה קאמרית.

6. קשיים ופתרונות

1. לשכת איטום הוא אחד המכשולים העיקריים שיש להתגבר עליהם. זה foאונד שדיסקים רחבים עם o-טבעות יש לך בעיה של ניקור וחיכוך מוגבר. על מנת להסיר את השפעות החיכוך, כמו גם למנוע ניקור, שיטה פשוטה של ​​מקליטת בוכנה עם הקלטת של שרברב הטפלון משמש. זה פותר את הבעיות ומייצר רמה ומשך לחץ רצוי.
2. התנהגות תא לחץ עצבית, במיוחד כשבוחן את מנגנון TBI משני או השפעות לטווח ארוך יותר, יש לבחון לאחר זמן רב לאחר דגירה. תא תא המכיל חשוף לפוטנציאל לא סטרילי תנאים תוך מעבר לבר Kolsky, pressurizing, ועל חזרה למכסת מנוע תרבית התאים. עם עיקור מראש של חלקים הקאמריים ותפעול תקין בהרכבה / פירוק של שקופית תא התרבותי ותא בתוך מכסה מנוע תרבית התאים, בטווח ארוך יותר לאחר הדגירה אפשרית עד מספר שבועות.
3. השחזור של הנתונים הוא פרמטר חשוב בניסויי גירוי מכאניים סלולריים. למכשיר שלנו, reproducibility בתגובת תאים עצביות נקבע כיצד רצוי פרופיל pressurization אימפולסיבית, היא ברמת לחץ ומשך, מתקבל שוב ושוב. מכיוון שאנו להקליט את פרופיל הלחץ התקבל לכל על לחץ, את הנתונים מפרופיל תגובת תא לחץ לא רצוי ניתן לשלול באופן ידני לאחר מכן.
4. השלבים השלמים pressurization, כולל קאמרית הרכבה, העברה ולעלות בKolsky הבר, על לחץ, העברת גב, וקאמרי פירוק, לוקחים פחות מ 10 דקות. השקופית תרבותי התא הבאה ניתן בלחץ מייד לאחר pressurization הקודם. לפיכך, מספר מספיק של ניסויי pressurization ניתן להשלים ביעילות. ההגדרה שלנו מנצלת 18 coverslips זכוכית בקוטר מ"מ. ניסוי pressurization אחד לא מספק מספיק חלבונים למערב immunoblotting בשל גודל מצע (וגם בין שאר משום שחלק מתאי הלחץ הם מת). שלושה ניסויים חוזרים ונשנים אודות pressurization לספק כמות חלבון הדרושה לimmunoblotting. שוב, השחזור נבדק כל זמן עם פרופיל הלחץ.

Discussion

רבים בטכניקות מבחנה ניסיונית כבר ניסינו לחקר ניזק לתאי מוח בתנאי TBI. אלה כוללים נוירון / מתיחת זרימה מושרה מתח astrocyte, גזירה, ירידה במשקל, חתך חרט, ליזר חיתוך רוחב, lithotripsy, וכו ^'4,5 זה כבר להניח שoverpressure בזמן קצר הוא גורם פיזי דומיננטי לTBI. ^6,7 במיוחד , שוקווייב של פיצוץ TBI יש משך פעימה של סדר אלפיות שניים. ⁴ מבוססים על הנחה ותצפית זו, קאמרית הברומטר מסוגל pressurization החולף פותח ומשמש להערכת התנהגות תא מוח בתנאי TBI. לדוגמה, בהקשת barotrauma הקאמרי נוזל דופק לחץ עם משך 20-30 אלפיות ארוכים ולחץ שיא של עד 0.5 מגפ"ס שבו בודק את התנהגות תא גלייה האנושית תחת TBI. ⁶ לאחרונה, VandeVord et al. ⁷ מתכת המשמשת קאמרי הברומטר כדור הפוגע לבחון את תא astrocyteהתנהגות תחת TBI אבל כדור המתכת בולטת פיק פולסים לחץ מרובים. במחקר זה, פתח מכשיר סלולרי על לחץ שיוצר רומן pressurization אימפולסיבית הסוג יחיד דופק. המכשיר פותח על בסיס הגדרת בר Kolsky, אשר שמש כמנגנון בדיקת חומר ^ב8 והשני של המחקרים שלנו. ^1,9 יכולת בדיקת החומר של Kolsky הבר בקצב טעינה גבוה מאוד שונתה כדי שתוכל תחול overpressure סוג היחיד דופק לתאים בתרבית בתוך תא לחץ הקבוע (איור 1). אנחנו יכולים לשלוט בהצלחה את העצמה ומשך overpressure אימפולסיבית. כתגובת תא נציג, הראינו כי ב2 תאי לחץ MPA SH-SY5Y עצביים להציג neurite משמעותי ואובדן אקסונלית בהשוואה לתאי בקרה קאמרי ללא לחץ.

לסיכום, אנו פתחנו מנגנון רומן אימפולסיבי תא לחץ קבוע באמצעות Kolsky תוכנן במיוחדמכשיר בר והפגין שימוש הפוטנציאל שלו בחקירת תגובת תא עצבית בתנאי TBI. אנחנו גם לציין כי טכניקה זו היא מאוד תכליתית שביכול להיות חשוף לכל סוג של תאים ללחצים אימפולסיביות ברמה ומשך שונים. לכן, מכשיר יכול לשמש כדי לחקור את ההתנהגות אימפולסיבית mechanotransduction הסלולרית לחץ המושרית, לא רק לפגיעה בתאים, אלא גם להמרצת התאים חיוביים בתפקודם ונחישות גורל.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) human neuroblastoma cells
18 mm diameter glass coverslips
Cell culture media: DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin
Retinoic acid (10 μM) for inducing neurogenesis
Kolsky bar impulsive pressurization device
Piston-cylinder cell pressurization chamber
Stainless steel screws for securing cell cultured coverslip on the piston
Grease for interfaces between cell chamber and Kolsky bar
General molecular biology supplies for assessing cell response to pressurization (fixative, antibody, fluorescent dye, PCR supplies, etc.)