Impulsiv Trycksättning av neuronala celler för traumatisk hjärnskada Studie

Summary

En ny impulsiv cell trycksättning experiment har utvecklats med hjälp av en Kolsky bar anordning för att undersöka de molekylära / cellulära mekanismer blast inducerad traumatisk hjärnskada.

Abstract

En ny impulsiv cell trycksättning experiment har utvecklats med hjälp av en Kolsky bar anordning för att undersöka blast-inducerad traumatisk hjärnskada (TBI). Vi visar i denna video artikeln hur blast TBI-relevanta impulsivt trycksättning appliceras på neuronala celler in vitro. Detta uppnås genom att använda väl kontrollerad tryckpuls som skapas av en specialiserad Kolsky bar enhet, med fullständig tryck historia inom cellen inspelade trycksättning kammare. Trycksatta neuronala celler kontrolleras omedelbart efter trycksättning eller inkuberades ytterligare undersöka de långsiktiga effekterna av impulsiva trycksättning på neurit / axonutväxt, neuronal genuttryck, apoptos, etc. Vi observerade att impulsiva trycksättning ca 2 MPa inducerar distinkt relativ neurit förlust till trycklös celler. Vår teknik tillhandahåller en ny metod för att undersöka de molekylära / cellulära mekanismer blast TBI, genom impulsiva trycksättning av hjärnceller vid välkontrollerade prEssure magnitud och varaktighet.

Protocol

1. Neuronal Cell Culture

1. Hjärnceller inkluderande neuronala celler, astrocyter, och deras sam-kultur kan användas som en cellmodell. Som en genomförbarhetsstudie demonstration är impulsiv trycksättning av cell-line neuronala celler presenteras.
2. SH-SY5Y humana neuroblastomceller (ATCC, CRL-2266) odlas på 18 mm täckglas diameter glas. Celler såddes vid en densitet av 3 x 10 ³ celler / cm ² med användning av odlingsmedier bestående av DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin. Cell odlade glasskivor hålls i en 5% CO ₂ fuktad inkubator vid 37 ° C.
3. För att erhålla den neuronala celldifferentiering av SH-SY5Y-celler, celler behandlade med medium ytterligare kompletterat med 10 pM retinsyra (RA) under 7 dagar med medium ändras varje två dagar. På dag 7, celler är redo att vara trycksatt.

2. Trycksättning Utrustning: Kolsky Bar

1. Den Kolsky bar, deutvecklats av Kolsky ¹ i 1949, har använts för att mäta mekaniska egenskaper hos ett material vid en mycket hög belastning hastighet. Apparaten består av två stänger med ett prov placerat i kontakt mellan staplarna. En påkänningsvåg, skapas på händelsen bar utbreder till provet där vågen delas upp i en reflekterad och överförs våg. Spänningen i provet är proportionell mot den överförda vågen. I denna studie använder vi en kammare cell trycksättning skall placeras mellan de två barerna i Kolsky set-up.
2. De två aluminiumlegering barer (vardera 6-m lång) är upphängd i linje mässing lager och en in vitro-cell trycksättning kammare är inklämt mellan stängerna. Den uppströms bar är det inträffade bar med en £ 130 massa fastspänd på ena änden. En friktion klämma placeras vid en position som kommer att ge den önskade pulslängden. Genom att engagera klämman och dra åt en sax domkraft mellan massan och en belastning stöd, är klämman-massa delen av infallande fältet före compressed till den önskade nivån. Att tvinga en skårad bult som låser klämman till en plötslig brytning med ett hydrauliskt system frigör förlagrade kompression snabbt och därmed genererar en tryckpuls. Detta fortplantas genom händelsen bar driver kolven testkammaren och trycksätter vätskan och celler i kammaren impulsivt. Kammaren trycksättning i sin tur initierar en tryckpuls som utbreder sig i de överförda bar nedströms. De stammar som är förknippade med de tryckpulser i stängerna mäts med sammansatta höga töjningsgivare exciteras till 45 volt. Mätaren signalerna spelas in med en digital oscilloskop vid 1 MHz frekvens som en belastning historia.
3. In vitro-cell trycksättning kammare består av en kolv-cylinder. Cylindern har 2,6 cm innerdiameter och 3,8 cm ytterdiameter, och har ett litet hål tappas vid basen av hålrummet. Hålet fungerar som en luft-och överflödig vätska Vent vid cellprov installationen. Kolven är 7,5 cm långoch är tillverkad av samma bar materialet. Kolven lindas med 02:58 skikt av rörmokare (teflon) tejp som tjänar som låg friktion tätning. Ändkåpan är 32 mm lång och har två små rostfria skruvar som håller fast täckglas (på vilka celler odlas) under laddningen.

3. Impulsiv Trycksättning av neuronala celler

1. Samtliga trycksättning kammare delar steriliseras med hjälp av autoklav och hålls under UV-ljus. Hopsättningen av kammaren sker inuti cellen kulturen huven. Avluftningsskruven i kammaren löst ingrepp i luftventilen vid basen av hålrummet. Förvärmd (37 ° C) färskt odlingssubstrat pipetteras in i kammaren utan att göra bubblor. Sedan en cell-odlade glasskiva plockas upp och placeras på locket av kolven (celler inför utanför). De små fästskruvar är åtdragna ned på bilden för att hålla den på plats. Kolven med en cell-odlad glasskiva sätts lite into kaviteten av kammaren, och anordningen lutas med ventilen är vid den högsta punkten. Avluftningsskruven avlägsnas och kolven trycks in i håligheten 1:a tvinga ut luftbubblor, då den överflödiga vätskan. Antingen ett referensmärke eller en jigg används som en vägledning för att säkerställa samma odlingsmediet volym för varje prov. Den axiella dimensionen av medierna i kammaren är ca 6 mm. Desinficera avluftningsskruven och ersätta den för att göra kammarens vattentät. Kammaren får inte läcka under denna statisk belastning, om det gör det, måste Teflon wrap som skall ersättas eller förstärkas.
2. Vid denna punkt, är Kolsky bar system återställs. Den tunga massan flyttas tillbaka till det ursprungliga läget och ett nytt låsbult ersätter används (bruten) en. Engagera den nya låsbult med hydraulik till ca 200 psi. Använd sax domkraft för att komprimera före lastning delen av händelsen bar upp till ett tryck något högre än det önskade värdet, och sedan backa ut att engagera hela friktionDomkraftens skruv. Den datainsamling är nu beväpnad.
3. Den sammansatta cellen trycksättning kammare monteras in i systemet. Den placeras i en V-blocket stöds av små labb sax domkraft och i linje med de två barerna. Smörj varje gränssnitt med en lätt fett lager och gnugga anliggande ytorna tillsammans för att eliminera eventuella luftspalter däremellan.
4. Testet är nu redo att fortsätta. Klämman Låsbulten tvingas att bryta genom att snabbt pumpa den hydrauliska klämman föraren. Klämman kommer att separera och datainsamlingen ska visa resultaten. Cellen trycksättning historia bestämmes från mätningarna av den sända bar övertryck. Om den överförda baren som används är tillräckligt lång, bör detta endast den första störningen till den punkt där mätningarna visar ett negativt tryck. Varaktigheten av den utsända pulsen kan vara kortare än den infallande puls om en bubbla instängd. Storleken får inte nå den infallande pulsen, men det bör ha en tillräckligt long platå före lossning. Annars kan antingen en stor luftbubbla i den förseglade kammaren eller en felinriktning mellan anordningen och en bar har inträffat.
5. Cellen trycksättning Kammaren avlägsnas sedan och demonteras inuti cellen kulturen huven. Avluftningsskruven avlägsnas och kolven dras fri från kammaren. Cellen-odlade objektglas tas från änden av kolven.

4. Bedöma Trycksatt cellbeteende

1. Efter trycksättning, kan cellerna inspekteras omedelbart eller inkuberades ytterligare under senare undersökning. Med rätt aseptiska drift processer är långsiktigt efter inkubation möjligt.
2. Trycksatta celler kan granskas av alla molekylär-och cellbiologi tekniker. Specifikt för neuronal cell trycksättning, för att undersöka den cellulära och molekylära fysiologi TBI förhållanden, analyser bedömer tryck-inducerade förändringar i neuritutväxt, mikrotubuli cytoskelett förändring, neuronal gen expression, apoptos, etc, kan utföras. Som kontroll cellprover, celler som odlas på samma, förvaras i trycksättningen kammaren för samma tidsperiod, men inte trycksatt används (sk kammare kontroll).
3. För att bedöma förändringar i neuritutväxt är trycksatt och kammaren kontrollceller undersökts av optiskt mikroskop omedelbart efter trycksättning och 1 och 24 h efter inkubation. Ett exempel på neuronala celler bilderna visas i "Representativa resultat avsnittet (Figur 2). Den neurite längdförändring kan kvantifieras genom aktin immunofluorescerande färgning och bildanalys. Cellerna fixeras med en 4% vikt / volym paraformaldehyd lösning, sköljdes med en 0,05% volym / volym Tween-20 tvättbuffert, och permeabiliserades med en 0,1% vol / vol Triton X-100-lösning. Efter blockering med en 1% vikt / volym bovint serumalbumin lösning, celler inkuberas med tetrametylrodaminisotiocyanat (TRITC)-konjugerade falloidin. Immunofluorescerande bilder av cellerna tas med hjälp av en fluorescerandemikroskop och längderna av neuriter för trycksatta och kontroll celler kvantifieras med användning av ImageJ mjukvara (NIH).
4. De neuriter kan identifieras som axoner eller dendriter. För att bedöma de morfologiska förändringar i axoner eller dendriter beskrivna experimenten ovan kan upprepas med användning av antikroppar som detekterar varje struktur, dvs, neurofilament (NF) antikropp för axoner och mikrotubulus-associerat protein (MAP2) antikropp för dendriter.
5. Mikrotubuli är en av de viktigaste cytoskelettala komponenter neuroner, och skadorna på mikrotubuli har använts som en markör av neuronal skada. ² mikrotubulus kan visualiseras immunofluorescently med β-tubulin-antikropp. Cellerna fixeras efter 0 och 24 h efter trycksättning, färgades med β-tubulin-antikropp, och observeras av fluorescensmikroskop.
6. För att bedöma effekten av impulsiva trycksättning på neuronal och apoptotiska genuttryck är total-RNA extraherat från trycksatta och kontroll celler. Gene uttryck kan undersökas genom att utföra kvantitativ RT-PCR eller realtids-RT-PCR, liknande våra publicerade protokoll. ³

5. Representativa resultat:

Figur 1. Ett exempel på tryckprofil appliceras på cellerna inuti kammaren trycksättning. Den Kolsky bar Apparaten genererar framgång 2 MPa nivå, enstaka puls typ impulsivt trycksättning med en löptid på cirka 0,7 ms.

Figur 2. Ett exempel av neuronal cellsvaret på impulsiv trycksättning. SH-SY5Y-celler exponerades för impulsiv trycksättning vid 2 MPa visar distinkt neurit / axon uppdelning i förhållande till celler kammaren kontroll.

6. Svårigheter och lösningar

1. Chamber tätning är en av de största hindren som måste övervinnas. Det är found som breda skivor med o-ringar har ett problem med mejsling och ökad friktion. För att avlägsna friktion effekter, liksom förhindrar mejsling, en enkel metod för kolvens tejpning med Teflon rörmokare tejp används. Detta löser problemen och åstadkommer önskad trycknivå och varaktighet.
2. Trycksatt neuronal cell beteende, särskilt vid bedömning av sekundär TBI mekanism eller långsiktiga effekter bör undersökas efter en lång efter inkubationstid. Den cellinnehållande kammaren utsätts för potentiellt osterila förhållanden när du flyttar till Kolsky baren, trycksättning, och flytta tillbaka till cellodling huven. Med pre-sterilisering av kammaren delar och väl fungerande vid montering / demontering av cell-odlade bilden och kammare inne i cellodling huven, långsiktiga efter inkubation är möjligt upp till flera veckor.
3. Reproducerbarheten av data är en viktig parameter i cellulära mekanisk stimulering experiment. För vår enhet har reproducibilitY i neuronal cellsvar bestäms hur önskad impulsiv trycksättning profil, både trycknivå och varaktighet, upprepat erhålls. Eftersom vi registrerar erhållna tryckprofilen för varje trycksättning, kan cell svarsdata från oönskade tryckprofil manuellt uteslutas efteråt.
4. Hela trycksättning steg, inklusive kammare montering, överföring och montera i Kolsky baren, trycksättning, överföring tillbaka och kammare demontering, ta mindre än 10 minuter. Nästa cell odlade bild kan vara trycksatt omedelbart efter den föregående trycksättning. Sålunda, kan tillräckligt antal trycksättning experiment fyllas effektivt. Vår set-up använder 18 mm täckglas diameter glas. En trycksättning experiment ger inte tillräckligt proteiner för Western immunoblotting grund substrat storlek (och även delvis eftersom några av de trycksatta celler är döda). Om tre upprepade trycksättning experiment ger protein mängd som krävs för immunoblotting. Återigen är reproducerbarheten kontrolleras varje gång med tryckprofilen.

Discussion

Många in vitro experimentella tekniker har försökt för att studera skador hjärncell i TBI förhållanden. Dessa inkluderar neuron / astrocyt stretching, strömningsinducerad skjuvspänning, vikt droppe, penna laceration, laser transection, litotripsi etc. ^4,5 Det har antagits att kortvarig övertryck är en dominerande fysisk faktor för TBI. ^6,7 Speciellt , chockvågen av tryckvågen TBI har en pulslängd av storleksordningen millisekunder. ⁴ Baserat på detta antagande och observation har barometer kammare kan övergående trycksättning utvecklats och använts för att bedöma beteende hjärncell i TBI förhållanden. Till exempel, i vätskan slagverk barotrauma kammaren en tryckpuls med 20-30 ms lång varaktighet och ett topptryck av upp till 0,5 MPa används för att undersöka den mänskliga gliaceller beteende under TBI. ⁶ Nyligen VandeVord et al. ⁷ använda metallen bollträff barometer kammare att undersöka astrocyt cellenbeteende under TBI men metallen bollträff producerat flera tryckpulser. I denna studie har vi utvecklat en ny enhet cell trycksättning som genererar en enstaka puls typ impulsivt trycksättning. Enheten har utvecklats baserat på Kolsky fältet installation, som har använts som material testapparat i våra ⁸ och andra studier. ^1,9 Den Kolsky barens materialprovning kapacitet vid mycket hög belastning takt har ändrats för att kunna tillämpa en enstaka puls övertryck typ till de odlade cellerna inom trycksättning kammaren (Figur 1). Vi kunde lyckas styra storleken och varaktigheten av den impulsiva övertryck. Som ett representativt cellsvar, visade vi att vid 2 SH-SY5Y MPa tryck neuronala celler uppvisar betydande neurit och axonal skada jämfört med icke trycksatt kammare celler kontroll.

Sammanfattningsvis har vi utvecklat en ny impulsiv apparat cell trycksättning med en speciellt utformad Kolskybar enhet och visat sin potential användning vid undersökning neuronal cell respons i TBI förhållanden. Vi noterar också att denna teknik är mycket mångsidig eftersom alla typer av celler kan utsättas för impulsiva tryck på olika nivå och varaktighet. Därför kan anordningen användas för att undersöka den impulsiva tryckinducerade cellulär mechanotransduction beteende, inte bara för att skada cellerna, utan också för positivt stimulera cellerna i deras funktion och öde bestämning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) human neuroblastoma cells
18 mm diameter glass coverslips
Cell culture media: DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin
Retinoic acid (10 μM) for inducing neurogenesis
Kolsky bar impulsive pressurization device
Piston-cylinder cell pressurization chamber
Stainless steel screws for securing cell cultured coverslip on the piston
Grease for interfaces between cell chamber and Kolsky bar
General molecular biology supplies for assessing cell response to pressurization (fixative, antibody, fluorescent dye, PCR supplies, etc.)