Summary
Bir roman dürtüsel hücre basınçlandırma deneme patlama-indüklenen travmatik beyin hasarının hücresel / moleküler mekanizmalarının araştırılması için bir Kolsky çubuğu aygıtı kullanılarak geliştirilmiştir.
Abstract
Bir roman dürtüsel hücre basınçlandırma deneme patlama bağlı travmatik beyin hasarı (TBI) araştırmak için bir Kolsky çubuğu aygıtı kullanılarak geliştirilmiştir. Biz patlama TBI-ilgili dürtüsel basınçlandırma in vitro nöronal hücrelerin nasıl uygulanacağını Bu video makalede göstermektedir. Bu kaydedilen hücre basınç odası içinde tam basınç geçmişi olan, özel bir Kolsky çubuk aygıtı tarafından oluşturulan iyi kontrol edilen bir basınç darbesi kullanılarak elde edilir. Basınçlı nöronal hücrelerin basınçlandırma hemen sonra muayene veya ayrı akson kaybı görece indükler Biz yaklaşık 2 MPa Atmalı basınçlandırma gözlenen aksonal / akson uzantısı, nöronal gen ekspresyonu, apoptozis, vb dürtüsel basınçlandırma uzun dönemli etkilerini incelemek için daha inkübe edilir basınçsız hücreleri için. Bizim tekniği iyi kontrollü pr beyin hücrelerinin dürtüsel basınçlandırma aracılığıyla TBI patlamanın hücresel / moleküler mekanizmalarını araştırmak için yeni bir yöntem sağlarbüyüklüğü ve süresi essure.
Protocol
1. Nöronal Hücre Kültürü
- Nöron hücreleri, astrositler, ve bunların eş-kültür dahil beyin hücreleri bir hücre modeli olarak kullanılabilir. Bir fizibilite gösterisi olarak, hücre hattı nöronal hücrelerin dürtüsel basınçlandırılması sunulmuştur.
- SH-SY5Y insan nöroblastom hücrelerinde (ATCC, CRL-2266) 18 mm çapında cam lameller üzerine kültüre. Hücreler 3 yoğunluğunda ekilmiş olan × DMEM oluşan büyüme ortamı kullanılarak 10 3 hücre / cm 2% 10 fetal bovin serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye. Hücre kültürlerinde cam slaytlar 37 ° C'de% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatör tutulur
- SH-SY5Y nöronal hücrelerin hücre farklılaşması elde etmek için, hücreler daha fazla medya ile 7 gün için 10 uM retinoik asit (RA) ile desteklenmiş ortam ile muamele edilir iki günde bir değiştirildi. 7. gün, hücreleri basınçlı olmaya hazırız.
2. Basınçlandırma Ekipmanı: Kolsky Bar
- Kolsky bar, de1949 yılında Kolsky 1 ile veloped, çok yüksek bir yükleme hızında bir malzemenin mekanik özelliğini ölçmek için kullanılmıştır. Cihaz çubuklar arasındaki temas halinde yerleştirilen bir örnek ile iki çubuk oluşur. Olay çubuğunda oluşturduğunuz bir stres dalgası, dalga yansıyan ve iletilen dalga böler örnek yayar. Örnek olarak gerilme iletilen dalga ile orantılıdır. Bu çalışmada, set-up Kolsky iki çubuk arasına yerleştirilmek üzere bir hücre basınç odası içermektedir.
- Iki alüminyum alaşımlı bar (her 6 m uzunluğunda) hizalanmış pirinç rulmanlar tarafından askıya alınır, ve in vitro hücre basınçlandırma odasında bir bar arasında sıkışmıştır. Yukarı çubuğun bir ucu üzerine kenetlenir bir £ 130 kitle olayı çubuktur. Bir sürtünme kelepçesini, istenen darbe süresi sağlayacak bir konumda yer alır. Kelepçe çekici ve kütle ve bir yükleme desteği arasındaki makas kriko sıkarak, olayın bar kelepçe-kütle bölümü pre-cistenilen seviyeye ompressed. Bir hidrolik sistem ile ani bir mola için kelepçe kilitleyen bir taraklı cıvata zorlamak hızla önceden saklanan sıkıştırma serbest bırakır ve böylece bir basınç darbesi üretir. Bu olay çubuğu yoluyla yayar, test odası piston sürücüler ve düşüncesizce odasının içindeki sıvı ve hücreler hermetikler. Sırayla odası basınçlandırma bulaşan barda aşağı yayılan bir basınç nabız başlatır. Barlarda basınç darbeleri ile ilişkili suşlar 45 volt için heyecanlı bileşik yüksek direnci strain gauge ile ölçülür. Ölçer sinyalleri bir yükleme tarihi olarak 1 MHz frekansında bir dijital osiloskop ile kaydedilir.
- İn vitro hücre basınç odasının içinde bir piston-silindir oluşur. Silindir 2.6 cm iç çapa ve 3.8 cm dış çapa sahiptir, ve boşluğunun tabanında dağılmış küçük bir delik vardır. Delik hücre örneği yükleme sırasında bir hava ve aşırı sıvı havalandırma olarak hizmet vermektedir. Piston 7.5 cm uzunluğundave aynı çubuk malzemeden imal edilir. Piston düşük sürtünme mühür olarak hizmet tesisatçı (Teflon) bant, iki ila üç kat sarılır. Uç kapağı uzunluğunda 32 mm ve yükleme sırasında cam lameller (hücreler kültüre edildiği) sabitleyen iki küçük paslanmaz çelik vidalar vardır.
3. Nöronal Hücre Dürtüsel Basınçlandırma
- Tüm basınç odası parçaları otoklav kullanarak sterilize edilir ve UV ışık altında tutulur. Odasının montaj hücre kültürü başlık içinde gerçekleştirilir. Odasındaki havalandırma vidası gevşek boşluğunun dibinde havalandırma devreye girer. Önceden ısıtılmış (37 ° C), taze büyüme ortamı kabarcıkları yapmadan odasının içine pipetle konulur. Daha sonra, bir hücre-kültür cam slayt alınır, ve (dış kaplama hücreleri), pistonun kapak üzerinde yerleştirilmiştir. Küçük tutan vidaları yerine tutmak için slayt üzerine aşağı sıkılır. Bir hücre-kültürlü cam slayt ile piston takıldığında biraz into odasının boşluğu ve montaj yüksek noktada olmanın havalandırma ile hareket ettirildiğinde. Tahliye deliğinden çıkarılır ve piston ilk önce hava kabarcıkları, fazla sıvı dışarı zorlamak boşluğu içine itilir. Ya bir referans işareti veya jig her test için aynı kültür ortamı hacmi sağlamak için bir kılavuz olarak kullanılır. Bölme içinde ortam eksenel boyutu 6 mm kadardır. Havalandırma vidasını Sanitize ve sıkı hazne suyu yapmak için değiştirin. Kamara yaparsa, teflon sarma değiştirilmesi veya güçlendirilmesi gerekmektedir, bu statik yük altında sızıntı olmamalıdır.
- Bu noktada, Kolsky bar sistemi sıfırlanır. Ağır kütle orijinal konumuna geri döndü ve yeni bir kilitleme vidası kullanılır (kırık) bir yerini alır. Yaklaşık 200 psi hidrolik yeni kilitleme cıvatasını takın. İstenilen değeri biraz daha yüksek bir basınca olayın bar ön yükleme bölümüne kadar sıkıştırmak için makas kriko kullanın ve sonra tam sürtünme meşgul onu gerikriko vida. Veri toplama artık silahlı.
- Toplanan hücre basınç odasına sistem içine monte edilir. Bu küçük laboratuar makası girişi tarafından desteklenen bir V blok yerleştirilir ve iki bar ile hizalanır. Hafif bir yağ tabakası ve arasında herhangi bir hava boşlukları ortadan kaldırmak için birlikte butting yüzeyler ovmak yağlayın Her arabirim.
- Testi artık devam etmeye hazır. Kelepçe kilitleme cıvatasını hızlı hidrolik kelepçe sürücüsü pompalayarak kırmak zorunda kalır. Sonuçlar kelepçe ayrı olacak ve veri toplama göstermelidir. Hücre basınç geçmiş iletilen çubuk ölçer ölçümü tespit edilir. Ikinci gönderilen çubuk yeterince uzun ise ölçümler bir negatif basınç göstermek durumlarda, bu sadece nokta için ilk rahatsızlık arasında olmalıdır. Bir kabarcık tutulur ise iletilen darbe süresi olay pulstan daha kısa olabilir. Büyüklük olay darbe bu ulaşmak mümkün olmayabilir, ama bu, bir yeterince lon olmalıdırboşaltma öncesinde g plato. Aksi takdirde, yalıtılmış bir bölmede veya montaj ve bir bar arasında bir hiza içinde büyük bir hava kabarcığı ya da oluşmuş olabilir.
- Hücre basınçlandırma kamara sonra kaldırılır ve hücre kültürü kaputu içinde söktürür. Tahliye deliğinden çıkarılır ve piston odasının serbest çekilir. Hücre kültür cam slayt, pistonun uç alınır.
4. Basınçlı Hücre Davranışı Değerlendirme
- Basınçlandırma sonra, hücreler hemen kontrol edilebilir ya da daha fazla, daha sonra muayene için inkübe edildi. Uygun aseptik işlem süreçleri ile, uzun vadeli post-inkübasyon mümkündür.
- Basınçlı hücreleri tüm moleküler ve hücre biyolojisi teknikleri ile incelenebilir. Özellikle nöronal hücre basınçlandırma için, tahliller akson uzantısı basınç indüklenen değişiklikler, mikrotübül sitoskeletal değişiklik, nöronal gen expre değerlendirirken, TBI koşullarda hücresel ve moleküler fizyolojisi araştırmakSsion, apoptoz, vb yapılabilir. Kontrolü hücre örneklerinin, aynı kültüre hücrelerin, aynı süre için basınçlandırma odasının içinde tutulur, ancak basınçlı değil (yani, oda kontrolü denir) kullanılır gibi.
- Akson uzantısı değişiklikleri değerlendirmek için, basınçlı ve oda kontrolü hücreler hemen basınçlandırma ve post-inkübasyon 1 ve 24 saat sonra optik mikroskopta incelenir. Nöronal hücre görüntü örneği 'Örnek' Sonuçları kesit (Şekil 2) 'de gösterilmektedir. Akson uzunluğu değişiklik aktin immünofloresan boyama ve görüntü analizi ile belirlenebilir. Hücreler% 0.05 v / v Tween-20 ile yıkama tamponu ile yıkanır bir% 4 w / v formaldehit çözeltisi ile çözülmüştür, ve bir% 0.1 h / h Triton X-100 çözeltisi ile permeabilize edilir. % 1 w / v sığır serum albümin ile bloke etme çözeltisi sonra, hücreler tetramethylrhodamine izotiyosiyanat (TRITC)-konjuge phalloidin ile inkübe edilir. Hücrelerin immünofloresan görüntüleri bir floresan ile alınırmikroskop ve basınçlı ve kontrol hücreleri için neurites uzunlukları ImageJ yazılım (NIH) kullanılarak ölçülür.
- Neurites akson ya da dendrit olarak tespit edilebilir. Akson ya da dendrit meydana gelen morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için, deney yukarıda açıklanan her yapı tespit antikorlar kullanılarak tekrar edilebilir, yani dendrit için akson ve mikrotübül ilişkili protein (map2) antikor nörofilament (NF) antikor.
- Mikrotübüller nöronların önemli sitoskeletal bileşenlerinden biridir ve mikrotübüller hasar nöronal hasarın bir göstergesi olarak kullanılmaktadır. 2 Mikrotubul β-tubulin antikoru kullanılarak immunofluorescently canlandırılabilir. Hücreler, post-basınçlandırma 0 ve 24 saat sonra sabit β-tubulin antikoru ile boyandı ve floresan mikroskobu ile gözlenmiştir.
- Nöronal ve apoptotik gen ekspresyonu dürtüsel basınçlandırma etkisini değerlendirmek için, toplam RNA basınçlı ve kontrol hücreleri elde edilir. GenE ifadesi bizim yayınlanan protokolleri benzer kantitatif RT-PCR veya gerçek zamanlı RT-PCR, yaparak muayene edilebilir. 3
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1. Basınç profilinin bir örneği, basınç odasının içindeki hücreler için uygulanabilir. Kolsky çubuğu cihazı başarıyla yaklaşık 0,7 ms süre ile 2 MPa seviyesine, tek-pulse tipi impulsif basınçlandırma üretir.
Şekil 2. Dürtüsel basınçlandırma için nöronal hücre yanıtı bir örnek. SH-SY5Y hücreleri odasına kontrol hücrelere göre 2 MPa gösterisi ayrı nörit / akson dağılımına dürtüsel basınçlandırma maruz.
6. Zorluklar ve Çözümler
- Oda sızdırmazlık üstesinden gelmek için en büyük engellerden biridir. Bu foo-ringler çapında diskler oyma ve artan sürtünme bir sorun var ki und. Sürtünme etkileri ortadan kaldırmak, hem de oluk açma, Teflon tesisatçının bant ile piston bantlama basit bir yöntem önlemek için kullanılır. Bu problemleri çözer ve istenilen basınç seviyesi ve süresi üretir.
- Basınçlı nöronal hücre davranışı, ikincil TBI mekanizması veya uzun vadeli etkileri değerlendirilirken, özellikle uzun bir post-inkübasyon süresinden sonra muayene edilmelidir. Hücre içeren odası, Kolsky bara geçmeden basınçlandırma ve hücre kültürü kaputu geri hareket ederken potansiyel koşulları steril maruz kalmaktadır. Odası parçaları ve / demontaj hücre kültürü kaputu içindeki hücre kültür slayt ve kamara, montajında düzgün çalışması öncesi sterilizasyon ile uzun vadeli post-inkübasyon birkaç haftaya kadar mümkündür.
- Verilerin tekrarlanabilirliği hücresel mekanik uyarım deneylerinde önemli bir parametredir. Bizim cihaz, reproducibilit içinnöronal hücre yanıtı y dürtüsel basınçlandırma istenen tercihi nasıl belirlenir, basınç seviyesi ve süresi hem de art arda elde edilir. Her basınçlandırma için elde edilen basınç profili kaydetmek yana, istenmeyen basınç profilden hücre yanıtı verileri el ile daha sonra bırakılabilir.
- Haznesi montaj, transfer ve Kolsky bar, basınçlandırma, transfer-sırt ve kamara sökme monte dahil tüm basınçlandırma adımları, en az 10 dakika sürer. Sonraki hücreye kültürlü slayt önceki basınçlandırma hemen sonra basınçlı olabilir. Bu nedenle, basınç deneyler, yeterli sayıda etkin bir şekilde yapılabilir. Bizim set-up 18 mm çaplı cam lameller kullanır. Bir basınç deney alt tabaka boyutuna bağlı olarak immünoblot batı için yeterli protein (ve aynı zamanda kısmen basınçlı bazı hücreler ölü çünkü) sağlamaz. Yaklaşık üç tekrarlanan basınçlandırma deneyler immunobl için gerekli protein miktarını sağlamakOtting. Yine, tekrarlanabilirlik basınç profili ile her zaman kontrol edilir.
Discussion
In vitro deneysel teknikler çoğu TBI koşullarda beyin hücre hasarı incelemek için teşebbüs edilmiştir. Bunlar bu kısa süreli basınç TBI için hakim fiziksel faktör olduğu kabul edilmiştir / astrosit germe, akış kaynaklı kayma gerilmesi nöron, ağırlık düşürme, stylus laserasyonu, lazer transeksiyonu, litotripsi, vb 4,5 bulunmaktadır. Özellikle 6,7 , TBI patlamanın shockwave milisaniye bir düzenin bir puls süresine sahiptir. 4 Bu varsayım ve gözlem dayanarak, geçici basınçlandırma yeteneğine barometre haznesi gelişmiş ve TBH koşullarda beyin hücre davranışlarını değerlendirmek için kullanılır olmuştur. Örneğin, sıvı perküsyon barotravma oda 0.5 MPa için yaklaşık 20-30 ms uzun süre ile kadar bir tepe basıncı ile ilgili bir basınç darbesi TBI'dan altında insan glial hücre davranışını incelemek için kullanılmıştır. 6. Son zamanlarda, VandeVord ve ark. 7 kullanılan metal astrosit hücre incelemek topu çarpıcı barometre haznesiTBI altında davranış ama metal bilye çoklu basınç darbesi çarpıcı. Bu çalışmada, tek-pulse tipi dürtüsel basınçlandırma üreten bir roman hücre basınçlandırma cihaz geliştirdik. Cihaz bizim 8 ve diğer adlı çalışmalarda bir malzeme test cihazı olarak kullanılmaktadır Kolsky bar set-up, üzerinde geliştirilmiştir. Çok yüksek yükleme hızında 1,9 Kolsky barın malzeme test yeteneği edebilmek için modifiye edilmiştir Basınç odası (Şekil 1) içinde kültür hücreleri tek-pulse tipi basınç uygulayın. Biz başarıyla dürtüsel basınç büyüklüğünü ve süresini kontrol edebilecek. Temsili bir hücre tepki olarak, basınçsız odasının kontrol hücrelerine kıyasla 2 MPa basınç SH-SY5Y nöronal hücrelerde anlamlı akson ve akson kaybı görüntülemek göstermiştir.
Sonuç olarak, biz özel tasarlanmış Kolsky kullanarak bir roman dürtüsel hücre basınçlandırma cihazları geliştirilmiştirbar cihaz ve TBH koşullarında nöronal hücre yanıtını araştıran yılında potansiyel kullanımını gösterdi. Biz de bu tekniğin her hücre tipine çeşitli seviye ve süresini de dürtüsel baskılara maruz kalabileceği çok yönlü olduğunu unutmayın. Bu nedenle, cihazı hücrelerinin yaralanmasına için değil, aynı zamanda da pozitif olarak işlev ve kaderini tayin olarak hücre uyarıcı için değil, sadece, itici basınç ile indüklenen hücre mechanotransduction davranışını incelemek için kullanılabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Travma Mekaniği Ordu-UNL Merkezi (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr Namas Chandra), UNL Layman Ödülü (26-1110-0033 -001 Yazarlar fon kaynaklarına teşekkür etmek istiyorum , PI: Lim).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) human neuroblastoma cells | |||
| 18 mm diameter glass coverslips | |||
| Cell culture media: DMEM, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin-streptomycin | |||
| Retinoic acid (10 μM) for inducing neurogenesis | |||
| Kolsky bar impulsive pressurization device | |||
| Piston-cylinder cell pressurization chamber | |||
| Stainless steel screws for securing cell cultured coverslip on the piston | |||
| Grease for interfaces between cell chamber and Kolsky bar | |||
| General molecular biology supplies for assessing cell response to pressurization (fixative, antibody, fluorescent dye, PCR supplies, etc.) |
References
- Kolsky, H. An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading. Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).
- Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration. FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).
- Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics. Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).
- Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury. J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).
- Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. Explosive blast neurotrauma. J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).
- Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury. J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).
- VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure. Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).
- Huang, H., Feng, R. A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment. Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).
- Song, B., Chen, W. Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials. Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).
