Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Трансплантация клеток непосредственно в почках взрослых данио рерио

Published: May 18, 2011 doi: 10.3791/2725

Summary

Клеточная трансплантация является важной техникой для изучения регенерации тканей и для развития клеточной терапии болезни. Мы демонстрируем здесь микрохирургической техники, которая позволяет трансплантации генетически меченых клеток непосредственно в почках взрослой рыбы данио рерио.

Abstract

Регенеративной медицины, основанной на трансплантации стволовых или прогениторных клеток в поврежденные ткани, имеет потенциал для лечения широкого спектра хронических заболеваний 1. Тем не менее, большинство органов не являются легкодоступными, что требует необходимости разработки хирургических методов, чтобы получить доступ к этим структурам. В этом видео статье мы опишем метод пересадки клеток непосредственно в почках взрослых данио, популярной моделью для изучения регенерации и болезней 2. Получатель рыбу предварительно обусловленных облучением для подавления иммунного отторжения от вводили клетки 3. Мы показываем, как головной почки могут быть выставлены на боковой разрез на фланге рыбу, после чего инъекции клеток непосредственно в подчиненный орган. Использование флуоресцентно меченных целом почек клеток костного мозга включает смешанную популяцию почек и кроветворных предшественников, мы покажем, что нефрона прародителей можно прививать и дифференцироваться в новые почечной ткани - золотой стандарт любой клеточной восстановительной терапии. Эта техника может быть адаптирована для доставки очищенного стебля или клеток-предшественников и / или малых молекул в почках, а также других внутренних органов и еще больше повышает данио, как универсальная модель для изучения регенеративной медицины.

Protocol

1. Кондиционирование нетрансгенных получателя рыбы.

  1. Выберите крупнейших мужчины рыбы в системе для трансплантации.
  2. Место рыб в 0,02% Tricaine (рН 7) в течение 3 минут или пока он не остановится плавание, но не так долго, что сердце перестает биться.
  3. Положите рыбу на анестезию влажным бумажным полотенцем на скамейке наверху.
  4. Используйте иглу инсулиновый шприц для введения 40 мкг гентамицин в 20 мкл воды в внутрибрюшинного полости рыбы. Для почечной исследований регенерации, этот шаг важен для стимулирования благоприятной среды для улучшения приживления.
  5. Положите рыбу обратно в водную систему для восстановления.
  6. Рыба может быть послушным и очень чувствительны к внешним стимулом, таких как вибрация. После 3 часов в режиме восстановления, лечения рыб с 25 серая гамма-облучения.
  7. Положите рыбу обратно в систему в течение 3 дней без пищи до трансплантации.

2. Подготовка клеток-предшественников донора генетически помечены флуоресцентным маркером (EGFP или mCherry).

  1. Непосредственно перед хирургической процедуры, подготовить донорских клеток для пересадки и держать их на льду.
  2. Для почечной исследований, мы используем весь почек клеток костного мозга от Tg (cdh17: EGFP) трансгенной линии, которые содержат функции почек и кроветворных клеток-предшественников. Эти клетки-предшественники, генетически маркировать и только выразить EGFP, если они прижился и дифференцироваться в почечных эпителиальных клеток. Другие типы меченых клеток-предшественников можно также использовать, например, Tg (SCL: EGFP) для гемопоэтических стволовых клеток или Tg (fli1a: EGFP) для ангиобласт прародителей трансплантации.
  3. Усыпить 3 взрослых трансгенных рыб, поместив их в 0,2% Tricaine течение 5 минут.
  4. Используйте стерилизованные лезвие, чтобы удалить голову и хвост, и рассекает ножницы, чтобы сделать срединный разрез вдоль брюшной стороны.
  5. Под стереоскоп, удалить все внутренние органы в полости тела, включая плавательный пузырь с помощью пинцета. Будьте осторожны, чтобы не удалить почку, которая является плоской и пигментных органа прилагаются к спинной стенке полости.
  6. Далее, из рассекают почку от дорсальной стенки и поместите его в 1,5 мл центрифужную пробирку, содержащую 300 мкл холодного солевого фосфатного буфера с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки (1X PBS / 2% FCS).
  7. Используйте пестиком стричь почки, пока не станет гомогенизации.
  8. Место 40 мкм сито ячейка внутри трубки 50 мл Сокол и передачи ячейки решение на верхней части ячейки фильтра, что позволяет свободно клеткам проникать в трубку Falcon.
  9. Используйте пестиком, чтобы мягко мазка большие куски ткани, которые остались на фильтр для дальнейшего распада клеток.
  10. Оставьте клетка решение в трубке Сокол и мыть сито с 1,2 мл 1X PBS / 2% FCS для сбора остаточных клеток из фильтра.
  11. Передача ячейке решение в новой трубки 1,5 мл и центрифуги при 4 ° С при 300 RCF течение 5 минут.
  12. Промыть осадок клеток с 1,5 мл 1X PBS / 2% FCS и передать его через новый фильтр для фильтрации сгустки липкого клеток и центрифуга снова.
  13. Ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл в 1X PBS / 2% FCS и трансфер в ПЦР-пробирку.
  14. Центрифуга ПЦР-пробирку (4 ° C, 300 RCF, 1 мин) и удалить большую часть супернатант.
  15. Ресуспендируют клеток в остаточной супернатант, чтобы получить 2-5 мкл конечный объем и сохранить его на лед.
  16. Заключительные сотовой выход должен быть около 2 млн. клеток на почки.
  17. Подсчитайте количество клеток с гемоцитометра и регулировать концентрацию до 5 х 10 5 клеток в мкл.

3. Нагрузка ячейки раствора в шприце Hamilton.

  1. Промойте шприц Гамильтон стерильной водой в 3 раза.
  2. Промойте шприц с 75% этанола в 3 раза.
  3. Промойте шприц снова 1X PBS / 2% FCS 3 раза.
  4. Затем загрузите шприц с 1 мкл клеточной решение содержится примерно 5 х 10 5 клеток непосредственно перед инъекцией.

4. Трансплантация клеток-предшественников, прямо в почки.

  1. Обезболить условный рыбы получателя в 0,02% Tricaine в течение примерно 3 минут, или пока рыба перестала двигаться, но не слишком долго, что сердце перестает биться.
  2. Под стереомикроскопа, положите рыбу на бумажное полотенце с головы влево, брюшной стороной вверх, для того, чтобы высушить пересаженных стороны.
  3. Затем раскатать рыбу подвергать сухой стороне.
  4. Использование стерилизовать пинцет, удалите масштабов в регионе сразу же позади жабр.
  5. Сделать 1 см боковой разрез в этой области на средней линии с помощью скальпеля при стабилизации ткани с помощью пинцета.
  6. Использование пинцета, подвергать ткани, продолжая при этом, чтобы сделать разрез достаточно глубокоподвергать голову почек.
  7. Если есть много кровотечение, которое препятствует визуализации почек, euthenize рыбы и начать все заново с другого получателя рыбы.
  8. Хотя любопытных ткани открытым, чтобы выставить голову почек, вводят 1 мкл клетка решение непосредственно в головной почки.
  9. Затем, в то же время, как иглу шприца в настоящее время восстановлена, релиз пинцетом так, чтобы ткань возвращается на круги своя, чтобы предотвратить утечку вводили клетки.
  10. Держите шов игла с водителем иглы и проколет ее через мышцу с каждой стороны разреза.
  11. Tie 2 узлов и отрезать избыточного шва. Только один шов необходимо для 1 см разрез.
  12. Место рыб в рыбе воды, содержащей 10 частей на миллион Tricaine в течение 5 часов поставлять рыбу с успокаивающим обезболивающее действие.
  13. Место рыбу обратно в систему для восстановления нормальной кормлений.
  14. После 7-18 дней на восстановление, мы проанализируем рыбы и анализировать приживление почечных клеток-предшественников живыми EGFP флуоресценции.

5. Представитель Результаты:

Общей стратегии трансплантации показано на рисунке 1. Для наших почечной исследований, почки рассекается и проанализированы EGFP флуоресценции. Приживление и дифференцировку клеток-предшественников почечной обнаруживается уже в семь дней после пересадки. Об этом свидетельствует наличие нескольких кластеров EGFP + почечных эпителиальных клеток (рис. 2). По состоянию на 18 дней после пересадки, мы обнаруживаем в среднем на 24 EGFP + нефронов, указывая, что донорские клетки сформировали новые ткани почек (рис. 3). Чтобы продемонстрировать долгосрочные приживления, мы расчлененный получателя рыбы 59 дней после трансплантации (рис. 4). Эта рыба имела много нефронов в месте инъекции (красная стрелка) в дополнение к нескольким нефронов в отдаленных районах (белые стрелки), предполагая, что почечные клетки-предшественники являются мигрирующими. Эта техника работает быстрее и более эффективно по сравнению с когда клетки вводятся в оборот через сердце, которое занимает около трех месяцев, чтобы обнаружить приживления.

Рисунок 1
Рисунок 1. Общая схема трансплантации. Нетрансгенных получателя рыбы облученных для подавления иммунного отторжения пересаженных клеток. Три дня спустя, разрез делается на фланге рыбы и клеток доноров предшественники вводятся в голову подвергаются почки. Разрез закрыт с одним швом и рыбу помещают обратно в систему для восстановления. Почки получателя рыбы расчленены на более поздних моментов времени и проанализированы для приживления и прогениторных деятельности.

Рисунок 2
Рисунок 2. Приживления клеток-предшественников, после семи дней. Приживление почечных клеток-предшественников обнаружен на вводили стороне головы, почек в семь дней после пересадки, как это определено наличие кластеров EGFP + почечных эпителиальных клеток (вставка - увеличенное изображение).

Рисунок 3
Рисунок 3. Приживления клеток-предшественников, через 18 дней после 18 дней после пересадки, мы обнаруживаем в среднем на 24 EGFP + доноров полученных нефронов (вставка - увеличенное изображение отдельных EGFP + нефронов)..

Рисунок 4
Рисунок 4. Приживление и миграции клеток-предшественников, через 59 дней. Мы продолжали обнаруживать приживления клеток-предшественников, долгое время после трансплантации, даже после 59 дней (красная голова стрелка). На этом позднем этапе, донорских полученных нефронов обнаружены на участках от места инъекции (белые наконечники стрел), в соответствии с прародитель миграции клеток.

Discussion

Методы Клеточная трансплантация имеют решающее значение для регенеративной исследования и являются золотым стандартом тест для измерения активности стволовых клеток. Здесь мы приводим метод пересадки клеток непосредственно в почках взрослых данио, чтобы определить стволовых и активность клеток-предшественников. Эта процедура включает в себя принятие разрез через мышцы, чтобы выставить голову почек с последующим введением клеток непосредственно в почках. Разрез закрыт с одного шва и работать рыбы 90-100% выживаемости. В наших экспериментах, привиты почечных клеток-предшественников обнаруживаются в 80-100% пересаженных рыб семь дней после трансплантации. Одним из ограничений данного метода является то, что разрез возле спинной аорты, которая может быть легко разрыв по скальпеля. Однако, как только освоили, скорость кровотечение может быть уменьшен до менее чем одного процента. Наш метод может быть адаптирован для проведения других типов клеток (крови, стромальные, или сосудистых), а также малых молекул в почках. Развитие этой техники будет способствовать продвижению регенеративной исследования и разрешения стволовых и потенциальных клеток-предшественников, подлежащих оценке в естественных условиях.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим ЕС Ляо за помощь в наложении швов, Р. Этье и Л. Gyr для ухода рыбок данио. AJD при поддержке Гарвардского института стволовых клеток, Американского общества нефрологии, и NIH / NIDDK (P50DK074030). CQD была поддержана Massachusetts General Hospital-фонд медицинских открытий.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Insulin syringe needle (28 gauge) BD Biosciences 329461
Cell strainer (40 uM) BD Biosciences 352340
Tricaine Sigma-Aldrich A5040
Hamilton syringe (26 gauge) Sigma-Aldrich 20734
Ethilon suture (size 9-0) Ethicon Inc. 2819G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hopkins, C., Li, J., Rae, F., Little, M. H. Stem cell options for kidney disease. The Journal of Pathology. 217, 265-281 (2009).
  2. Brittijn, S. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
  3. Traver, D. Effects of lethal irradiation in zebrafish and rescue by hematopoietic cell transplantation. Blood. 104, 1298-1305 (2004).

Tags

Клеточной биологии выпуск 51 данио рерио почки регенерация трансплантации
Трансплантация клеток непосредственно в почках взрослых данио рерио
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diep, C. Q., Davidson, A. J.More

Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725, doi:10.3791/2725 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter