Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Summary

Trapianto di cellule è una tecnica fondamentale per lo studio e la rigenerazione dei tessuti per lo sviluppo di terapie basate sulle cellule della malattia. Si dimostra qui una tecnica di microchirurgia che permette il trapianto di cellule geneticamente etichettati direttamente nel rene di pesce zebrafish adulti.

Abstract

Medicina rigenerativa basata sul trapianto di cellule staminali o progenitrici nei tessuti danneggiati ha il potenziale per trattare una vasta gamma di malattie croniche ^1. Tuttavia, la maggior parte degli organi non sono facilmente accessibili, sottolineando la necessità di sviluppare metodi chirurgici per ottenere l'accesso a queste strutture. In questo articolo il video, si descrive un metodo per trapiantare le cellule direttamente nel rene adulto di zebrafish, un modello popolare per studiare la rigenerazione e la malattia ^2. Pesce destinatario sono pre-condizionati da irradiazione per sopprimere il rigetto immunitario delle cellule iniettate ^3. Noi dimostrare come il rene testa può essere esposto da una incisione laterale sul fianco del pesce, seguito da l'iniezione di cellule direttamente all'organo. Utilizzando fluorescente intero cellule del midollo renali composto da una popolazione mista di precursori emopoietici e renale, abbiamo dimostrato che progenitori nefrone può innestare e differenziarsi in nuovo tessuto renale - il gold standard di terapia cellulare rigenerativa. Questa tecnica può essere adattata per fornire purificato le cellule staminali o progenitrici e / o piccole molecole per il rene e altri organi interni e migliora ulteriormente il pesce zebra come modello versatile per studiare medicina rigenerativa.

Protocol

1. Condizionamento di non transgenici pesce destinatario.

1. Seleziona il pesce più grande maschio nel sistema per il trapianto.
2. Mettere il pesce in Tricaine 0,02% (pH 7) per circa 3 minuti o fino a quando non smette di nuotare, ma non così tanto tempo che il cuore smette di battere.
3. Mettere il pesce anestetizzato su un tovagliolo di carta umido su un banco.
4. Utilizzare un ago da siringa per insulina da iniettare 40 ug di gentamicina in 20 uL di acqua nella cavità intraperitoneale del pesce. Per gli studi di rigenerazione renale, questo passaggio è importante per indurre un ambiente favorevole per l'attecchimento del trapianto migliorata.
5. Mettete il pesce in acqua sistema per il recupero.
6. Il pesce può essere docile e molto sensibile a stimoli esterni quali vibrazioni. Dopo 3 ore di recupero, trattare il pesce con 25 grigio di raggi gamma.
7. Mettete il pesce nel sistema per 3 giorni senza cibo prima del trapianto.

2. Preparazione delle cellule progenitrici del donatore geneticamente etichettato con un marcatore fluorescente (EGFP o mCherry).

1. Poco prima della procedura chirurgica, preparare le cellule del donatore da trapiantare e tenerli su ghiaccio.
2. Per gli studi renale, usiamo tutta cellule renali midollo dal Tg (cdh17: EGFP) linea transgenica, che contengono cellule progenitrici ematopoietiche e renali. Queste cellule progenitrici sono geneticamente etichettati e solo esprimere EGFP se innestare e differenziarsi in cellule epiteliali renali. Altri tipi di cellule progenitrici etichettati può essere utilizzato anche come Tg (SCL: EGFP) per le cellule staminali ematopoietiche o Tg (fli1a: EGFP) per i trapianti angioblast progenitori.
3. Euthanize 3 pesci transgenici adulti mettendoli nello 0,2% Tricaine per 5 minuti.
4. Utilizzare una lama di rasoio sterile per rimuovere la testa e la coda, e forbici dissezione di fare una incisione mediana lungo il lato ventrale.
5. Sotto uno stereoscopio, rimuovere tutti gli organi interni nella cavità del corpo tra cui la vescica natatoria con le pinzette. Fare attenzione a non rimuovere il rene, che è un organo piatto e pigmentate attaccato alla parete dorsale della cavità.
6. Successivamente, sezionare fuori il rene dalla parete dorsale e metterla in una provetta di centrifuga da 1,5 ml contenenti 300 uL di soluzione salina tampone fosfato freddo integrato con il 2% di siero fetale bovino (1X PBS / 2% FCS).
7. Utilizzare un pestello di taglio del rene fino a quando diventa omogenea.
8. Posizionare un colino 40 uM cella all'interno di un tubo da 50 ml Falcon e trasferire la soluzione di cellule sulla parte superiore del filtro cellulare, permettendo alle cellule perdere di filtrare attraverso la colonna Falcon.
9. Utilizzare il pestello per spalmare delicatamente i pezzi grossi di tessuto che vengono lasciati sul filtro per rompere ulteriormente le cellule.
10. Lasciare la soluzione di cellule nel tubo Falcon e lavare il filtro con 1,2 ml di PBS 1X / 2% FCS per raccogliere le cellule residue dal filtro.
11. Trasferire la soluzione di cellula in un nuovo tubo di 1,5 ml e centrifugare a 4 ° C a 300 rcf per 5 minuti.
12. Lavare il pellet di cellule con 1,5 ml di PBS 1X / 2% FCS e passarlo attraverso un colino per filtrare i nuovi grumi di cellule appiccicoso e centrifugare di nuovo.
13. Risospendere il pellet di cellule in 200 uL di di 1X PBS / 2% FCS e trasferire in una provetta da PCR.
14. Centrifugare la provetta PCR (4 ° C, 300 RCF, 1 min) e rimuovere la maggior parte surnatante.
15. Risospendere le cellule nel sopranatante residuo per ottenere un volume di 2-5 uL finale e memorizzarlo sul ghiaccio.
16. Finale resa cellulari dovrebbero essere circa 2 milioni di cellule per rene.
17. Contare il numero di cellule con un emocitometro e regolare la concentrazione di 5 x 10 ⁵ cellule per uL.

3. Caricare il cellulare soluzione in una siringa Hamilton.

1. Sciacquare la siringa Hamilton con acqua sterile 3 volte.
2. Sciacquare la siringa con il 75% di etanolo 3 volte.
3. Sciacquare la siringa ancora una volta con PBS 1X / 2% FCS 3 volte.
4. Quindi caricare la siringa con 1 uL di soluzione delle cellule contengono circa 5 x 10 ⁵ cellule poco prima dell'iniezione.

4. Il trapianto di cellule progenitrici direttamente nel rene.

1. Anestetizzare il pesce condizionata destinatario nel 0,02% Tricaine per circa 3 minuti, o fino a quando il pesce ha smesso di muoversi, ma non troppo lungo che il cuore smette di battere.
2. Sotto uno stereomicroscopio, giaceva il pesce su un tovagliolo di carta con la testa verso sinistra, lato ventrale in su, al fine di asciugare la parte trapiantata.
3. Poi tira il pesce sopra per esporre la parte secca.
4. Utilizzando una pinzetta sterile, togliere le squame nella regione immediatamente posteriore alla branchie.
5. Effettuare una incisione laterale 1 cm di questo settore a linea mediana con un bisturi pur stabilizzando il tessuto con le pinzette.
6. Con le pinze, esporre il tessuto, pur continuando a fare l'incisione abbastanza profondaper esporre il rene testa.
7. Se c'è un sacco di sanguinamento che impedisce la visualizzazione del rene, euthenize il pesce e ricominciare con un altro pesce destinatario.
8. Indiscreti mentre il tessuto aperto per esporre il rene testa, iniettare 1 uL della soluzione cellulare direttamente nel rene testa.
9. Poi, al tempo stesso come l'ago della siringa viene recuperata, rilasciare le pinzette in modo che il tessuto cade al suo posto per evitare perdite delle cellule iniettate.
10. Tenere un ago di sutura con un driver ago e perforare attraverso il muscolo su entrambi i lati dell'incisione.
11. Tie 2 nodi e tagliare la sutura in eccesso. Solo una sutura singola è necessario per una incisione 1 cm.
12. Collocare il pesce in acqua i pesci contenenti 10 parti per milione di Tricaine per 5 ore per fornire pesce con un effetto calmante analgesico.
13. Collocare il pesce nel sistema per il recupero con alimentazioni normali.
14. Dopo 7-18 giorni di recupero, abbiamo sezionare il pesce e analizzare l'attecchimento delle cellule progenitrici renali da vivere EGFP fluorescenza.

5. Rappresentante dei risultati:

La strategia complessiva del trapianto è illustrato nella figura 1. Per i nostri studi renale, il rene è sezionato e analizzato da EGFP fluorescenza. Attecchimento e la differenziazione delle cellule progenitrici renali viene rilevato come già sette giorni dopo il trapianto. Ciò è evidente dalla presenza di più cluster di EGFP ⁺ cellule epiteliali renali (Figura 2). Da 18 giorni dopo il trapianto, si rileva una media di 24 EGFP ⁺ nefroni, indicando che le cellule del donatore hanno formato nuovo tessuto renale (Figura 3). Per dimostrare a lungo termine attecchimento, abbiamo sezionato un pesce destinatario dopo 59 giorni trapianto (Figura 4). Questo pesce ha molti nefroni nel sito di iniezione (freccia rossa) in aggiunta ai nefroni multipli in siti distanti (punte di freccia bianca), suggerendo che le cellule progenitrici renali sono migratori. Questa tecnica è più veloce e più efficiente rispetto a quando le cellule vengono iniettate in circolo attraverso il cuore, che dura circa tre mesi per rilevare l'attecchimento del trapianto.

Figura 1. Schema generale del trapianto. Pesci non transgenici destinatario sono irradiati per impedire il rigetto immunitario delle cellule trapiantate. Tre giorni dopo, un'incisione è fatta sul fianco del pesce e delle cellule progenitrici del donatore vengono iniettate nel rene testa esposta. L'incisione è chiusa con una sutura e pesce è messo di nuovo nel sistema per il recupero. Reni dei pesci destinatario sono sezionati nei punti secondo momento e analizzati per l'attecchimento e l'attività delle cellule progenitrici.

Figura 2. Attecchimento delle cellule progenitrici dopo sette giorni. Attecchimento delle cellule progenitrici renali viene rilevato sul lato iniettato del rene capo a sette giorni dopo il trapianto, come determinato dalla presenza di gruppi di EGFP ⁺ cellule renali epiteliali (inserto - visualizzazione ingrandita).

Figura 3. Attecchimento delle cellule progenitrici dopo 18 giorni Dopo 18 giorni dopo il trapianto, si rileva una media di 24 EGFP ⁺ donatore-derivati ​​nefroni (inserto - ingrandimento dei singoli EGFP ⁺ nefroni)..

Figura 4. Attecchimento e la migrazione delle cellule progenitrici dopo 59 giorni. Abbiamo continuato a rilevare l'attecchimento delle cellule progenitrici molto tempo dopo il trapianto, anche dopo 59 giorni (testa di freccia rossa). A questo punto secondo momento, donatore-derivati ​​nefroni vengono rilevati in siti di distanza dal sito di iniezione (bianco teste di freccia), in linea con la migrazione delle cellule progenitrici.

Discussion

Tecniche di trapianto di cellule sono cruciali per gli studi rigenerativa e sono il test gold standard per misurare l'attività delle cellule staminali. Qui riportiamo un metodo per trapiantare le cellule direttamente nel rene adulto di zebrafish per determinare l'attività delle cellule staminali e progenitrici. Questa procedura consiste nel fare un'incisione attraverso il muscolo per esporre il rene testa, seguito da iniezione di cellule direttamente nel rene. L'incisione viene chiusa con una sutura singola e il pesce impiegati hanno un tasso di sopravvivenza del 90-100%. Nei nostri esperimenti, innestate con cellule progenitrici renali vengono rilevati nel 80-100% dei pesci trapiantato post-trapianto di sette giorni. Un limite di questa tecnica è che l'incisione è vicino l'aorta dorsale, che può essere facilmente rotto dal bisturi. Tuttavia, una volta masterizzato, il tasso di sanguinamento può essere ridotto a meno dell'uno per cento. Il nostro metodo potrebbe essere adattato per fornire altri tipi di cellule (sangue, stromali, o vascolari) e piccole molecole al rene. Lo sviluppo di questa tecnica aiuta studi anticipo rigenerativa e delle cellule staminali e permettere il potenziale progenitore di essere valutata in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insulin syringe needle (28 gauge)	BD Biosciences	329461
Cell strainer (40 uM)	BD Biosciences	352340
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Hamilton syringe (26 gauge)	Sigma-Aldrich	20734
Ethilon suture (size 9-0)	Ethicon Inc.	2819G