Transplantatie van cellen direct in de nieren van Volwassen zebravis

Summary

Celtransplantatie is een essentiële techniek voor het bestuderen van weefselregeneratie en voor het ontwikkelen van cel-gebaseerde therapieën van de ziekte. We zien hier een microchirurgische techniek die de transplantatie van genetisch gemerkte cellen vergunningen direct in de nier van volwassen zebravissen vis.

Abstract

Regeneratieve geneeskunde op basis van de transplantatie van stamcellen of voorlopercellen in beschadigd weefsel heeft de potentie om een breed scala van chronische ziekten ^een te behandelen. Echter, de meeste organen zijn niet gemakkelijk toegankelijk, noodzakelijk de behoefte aan chirurgische methoden te ontwikkelen om de toegang tot deze structuren te krijgen. In deze video artikel beschrijven we een methode voor het transplanteren van cellen direct in de nieren van volwassen zebravis, een populair model voor regeneratie en ziekte ² studie. De ontvanger vissen zijn vooraf geconditioneerd door middel van bestraling op de afstoting van de geïnjecteerde cellen ³ te onderdrukken. We zien hoe het hoofd nier kan worden blootgesteld door een laterale incisie in de flank van de vis, gevolgd door de injectie van cellen direct in het orgel. Met behulp van fluorescent gelabelde hele nier beenmerg cellen die een gemengde bevolking van nier-en hematopoietische precursoren, laten we zien dat nefron voorouders kunnen inenten en te differentiëren in nieuwe nier-weefsel - de gouden standaard van een cel-gebaseerde regeneratieve therapie. Deze techniek kan worden aangepast aan leveren gezuiverde stamcellen of voorlopercellen cellen en / of kleine moleculen aan de nieren en andere inwendige organen en versterkt bovendien de zebravis als een veelzijdig model voor regeneratieve geneeskunde studeren.

Protocol

1. Conditionering van niet-transgene ontvanger vis.

1. Kies de grootste mannelijke vissen in het systeem voor transplantatie.
2. Leg de vis in 0,02% tricaïne (pH 7) voor ongeveer 3 minuten, of totdat het stopt zwemmen, maar niet zo lang, dat het hart stopt met kloppen.
3. Leg de verdoofde vis op een vochtige papieren handdoek op een bankje top.
4. Gebruik een insuline naald tot 40 ug van gentamicine injecteren in 20 uL van water in de intraperitoneale holte van de vis. Voor de nier-regeneratie studies, deze stap is belangrijk voor het induceren van een gunstig klimaat voor een betere engraftment.
5. Leg de vis in het systeem van water voor herstel.
6. De vis kan worden volgzaam en zeer gevoelig voor externe prikkels, zoals trillingen. Na 3 uur van herstel, behandel de vis met 25 grijs van gammastraling.
7. Leg de vis terug in het systeem voor drie dagen zonder eten voorafgaand aan de transplantatie.

2. Voorbereiding van de voorlopercellen donor cellen genetisch gemerkt met een fluorescente marker (EGFP of mCherry).

1. Vlak voor de chirurgische procedure, de voorbereiding van de donor cellen worden getransplanteerd en bewaar ze op ijs.
2. Voor de nier studies, gebruiken we hele nieren beenmerg cellen van de Tg (cdh17: EGFP) transgene lijn, die nier-en hematopoietische stamcellen bevatten. Deze progenitor cellen zijn genetisch gelabeld en zal alleen uiten EGFP als ze inenten en differentiëren in renale epitheelcellen. Andere soorten van gelabelde stamcellen kunnen ook worden gebruikt, zoals Tg (SCL: EGFP) voor hematopoietische stamcellen of Tg (fli1a: EGFP) voor angioblast voorlopers transplantaties.
3. Euthanaseren drie volwassen transgene vis door ze in 0,2% tricaïne gedurende 5 minuten.
4. Gebruik een gesteriliseerde scheermes aan de kop en staart, en het ontleden van een schaar te verwijderen om een ​​middellijn incisie te maken langs de buikzijde.
5. Onder een stereoscoop, verwijdert u alle van de interne organen in het lichaam holte onder de zwemblaas met een pincet. Wees voorzichtig dat u de nieren, dat is een plat en gepigmenteerde orgel verbonden aan de dorsale wand van de holte te verwijderen.
6. Vervolgens ontleden de nier van de dorsale wand en plaats deze in een 1,5 ml centrifuge buisje met 300 uL van koude fosfaatbuffer zoutoplossing aangevuld met 2% foetaal kalf serum (1X PBS / 2% FCS).
7. Gebruik een stamper om afschuiving van de nier tot het wordt gehomogeniseerd.
8. Plaats een 40 uM cel zeef in een 50 ml Falcon buis en breng de cel-oplossing op de top van de cel zeef, waardoor de losse cellen om door filter in de Falcon buis.
9. Gebruik de stamper om voorzichtig smeren van de grote stukken weefsel die links op de zeef om verder te breken van de cellen.
10. Laat de cel oplossing in de Falcon buis en was het filter met 1,2 ml 1X PBS / 2% FCS om de resterende cellen van de zeef te halen.
11. Breng de cel oplossing in een nieuwe 1,5 mL buis en centrifugeer bij 4 ° C bij 300 RCF gedurende 5 minuten.
12. Was de celpellet met 1,5 ml 1X PBS / 2% FCS en doorgeven door middel van een nieuwe filter te filteren op klompen kleverige cellen en weer centrifuge.
13. Resuspendeer de cel pellet in 200 uL van van 1X PBS / 2% FCS en over te dragen aan een PCR-buis.
14. Centrifugeer de PCR-buis (4 ° C, 300 RCF, 1 min) en verwijder het grootste deel van supernatant.
15. Resuspendeer de cellen in de resterende supernatant naar een 2-5 uL eindvolume te krijgen en op te slaan op het ijs.
16. Final cellulaire opbrengst moet worden ongeveer 2 miljoen cellen per nier.
17. Tel het aantal cellen met een hemocytometer en stel de concentratie 5 x 10 ⁵ cellen per UL.

3. Laad de cel oplossing in een Hamilton spuit.

1. Spoel de Hamilton spuit met steriel water 3 keer.
2. Spoel de spuit met 75% ethanol 3 keer.
3. Weer Spoel de spuit met 1X PBS / 2% FCS 3 keer.
4. Laad daarna de spuit met 1 uL van cel-oplossing bevat ongeveer 5 x 10 ⁵ cellen vlak voor injectie.

4. Transplantatie van stamcellen direct in de nier.

1. Verdoven van de geconditioneerde ontvanger vis in 0,02% tricaïne voor ongeveer 3 minuten, of totdat de vis is gestopt met bewegen, maar niet te lang, dat het hart stopt met kloppen.
2. Onder een stereomicroscoop, leg de vis op een papieren handdoek met het hoofd naar links, ventrale kant naar boven, om te drogen uit de getransplanteerde kant.
3. Rol dan de vis naar de gedroogde kant bloot te leggen.
4. Met behulp van gesteriliseerde pincet, verwijder de schalen in de regio direct achterste naar de kieuwen.
5. Maak een 1 cm laterale incisie op dit gebied op de middenlijn met een scalpel, terwijl het stabiliseren van de weefsel met een pincet.
6. Met behulp van de pincet, bloot het weefsel terwijl u de incisie te maken diep genoegnaar het hoofd nieren bloot te leggen.
7. Als er een veel bloeden, dat visualisatie van de nier voorkomt, euthenize de vis en opnieuw beginnen met een andere ontvanger vis.
8. Terwijl nieuwsgierige het weefsel te openen naar het hoofd nieren bloot te leggen, injecteer 1 uL van de cel oplossing direct in de kop nier.
9. Dan, op hetzelfde moment als de naald van de spuit wordt opgehaald, laat u de pincet zodat het weefsel valt weer op zijn plaats om te voorkomen dat lekken van de geïnjecteerde cellen.
10. Houd een hechtdraad naald met een chauffeur en die doorboren door de spieren aan beide zijden van de incisie.
11. Tie twee knopen en snijd het overtollige hechtdraad. Slechts een enkele hechting nodig is voor een 1 cm incisie.
12. Leg de vis in het water met 10 delen per miljoen van tricaïne voor 5 uur te vissen te voorzien van een rustgevend pijnstillend effect.
13. Leg de vis terug in het systeem voor het herstel met normale voeding.
14. Na 7-18 dagen van herstel, ontleden we de vis en analyseren innesteling van renale progenitor cellen door live-EGFP fluorescentie.

5. Representatieve resultaten:

De algemene strategie van de transplantatie wordt geïllustreerd in figuur 1. Voor onze nier-studies, is de nier ontleed en geanalyseerd door EGFP fluorescentie. Innesteling en differentiatie van de renale progenitorcellen wordt gedetecteerd zo vroeg zeven dagen na de transplantatie. Dit wordt duidelijk door de aanwezigheid van meerdere clusters van EGFP ⁺ renale epitheelcellen (figuur 2). Door 18 dagen na de transplantatie, ontdekken we een gemiddelde van 24 EGFP ⁺ nefronen, wat aangeeft dat de donor cellen zijn nieuwe nier weefsel gevormd (figuur 3). Om aan te tonen op lange termijn aanslaan, we ontleed een ontvanger vis 59 dagen na de transplantatie (figuur 4). Deze vis veel nefronen had op de plaats van injectie (rode pijlpunt) in aanvulling op meerdere nefronen op verre locaties (witte pijlpunten), wat suggereert dat een nier-progenitorcellen trekvogels zijn. Deze techniek is sneller en efficiënter dan wanneer de cellen worden ingespoten in de circulatie via het hart, dat duurt ongeveer drie maanden op te sporen engraftment.

Figuur 1. Algemene regeling van de transplantatie. Non-transgene ontvanger vissen bestraald om afstoting van de getransplanteerde cellen te onderdrukken. Drie dagen later, een incisie wordt gemaakt op de flank van de vis en de donor progenitor cellen worden geïnjecteerd in de blootgestelde hoofd nier. De incisie wordt gesloten met een hechtdraad en vis worden terug geplaatst in het systeem voor herstel. Nieren van de ontvanger vis ontleed op latere tijdstippen en geanalyseerd voor de innesteling en voorlopercellen activiteit.

Figuur 2. Innesteling van progenitorcellen na zeven dagen. Innesteling van renale progenitorcellen is gedetecteerd op de geïnjecteerde kant van het hoofd nier op zeven dagen na de transplantatie, zoals bepaald door de aanwezigheid van clusters van EGFP ⁺ renale epitheelcellen (inzet - vergrote weergave).

Figuur 3. Innesteling van progenitor cellen na 18 dagen Na 18 dagen na de transplantatie, ontdekken we een gemiddelde van 24 EGFP ⁺ donor-afgeleide nefronen (insert - vergrote weergave van de individuele EGFP ⁺ nefronen)..

Figuur 4. Innesteling en migratie van stamcellen na 59 dagen. We zijn doorgegaan met innesteling van progenitorcellen lang na de transplantatie te detecteren, zelfs na 59 dagen (rode pijl hoofd). Op dit later tijdstip, worden donor-afgeleide nefronen ontdekt op plaatsen uit de buurt van de plaats van injectie (witte pijlpunten), consistent met progenitor cel migratie.

Discussion

Celtransplantatie technieken zijn cruciaal voor regeneratieve studies en zijn de gouden standaard test voor het meten van stamcellen activiteit. Hier melden wij een methode voor het transplanteren van cellen direct in de nieren van volwassen zebravis aan stam en progenitor cel-activiteit te bepalen. Deze procedure houdt in het maken van een incisie door de spieren aan het hoofd nieren, gevolgd door injectie van cellen direct in de nieren bloot te leggen. De incisie wordt gesloten met een enkele hechting en de geopereerde vissen hebben een 90-100% overlevingskans. In onze experimenten, zijn geënt renale progenitorcellen gedetecteerd in 80-100% van de getransplanteerde vis met zeven dagen na transplantatie. Een beperking van deze techniek is dat de incisie in de buurt van de dorsale aorta, die gemakkelijk kan worden verbroken door de scalpel. Echter, eenmaal onder de knie, kan de snelheid van bloeden worden teruggebracht tot minder dan een procent. Onze methode zou kunnen worden aangepast aan andere soorten cellen (bloed, stromale, of vasculaire) als kleine moleculen te leveren aan de nieren. De ontwikkeling van deze techniek zal helpen vooruit regeneratieve studies en vergunning stam en progenitor cel potentieel om te worden beoordeeld in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insulin syringe needle (28 gauge)	BD Biosciences	329461
Cell strainer (40 uM)	BD Biosciences	352340
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Hamilton syringe (26 gauge)	Sigma-Aldrich	20734
Ethilon suture (size 9-0)	Ethicon Inc.	2819G