Transplantation av celler direkt in i njuren för vuxna Zebrafish

Summary

Cell Transplantation är en viktig teknik för att studera vävnad förnyelse och för att utveckla cellbaserade terapier för sjukdomar. Vi visar här ett mikrokirurgisk teknik som möjliggör transplantation av genetiskt märkta celler direkt i njurarna av vuxna zebrafisk fisk.

Abstract

Regenerativ medicin baserad på transplantation av stamceller eller stamceller till skadade vävnader har potential att behandla ett brett spektrum av kroniska sjukdomar ^1. Men de flesta organ är svårtillgängliga, vilket kräver behovet av att utveckla kirurgiska metoder för att få tillgång till dessa strukturer. I denna video artikeln beskriver vi en metod för att transplantera celler direkt i njurarna hos vuxna zebrafisk, en populär modell för att studera föryngring och sjukdom ^2. Mottagare fisk är konditionerade med strålning att undertrycka avstötning av det injicerade cellerna ^3. Vi visar hur huvudet njuren kan exponeras genom ett lateralt snitt i flanken av fisk, följt av injektion av celler direkt in i orgeln. Använda fluorescerande hela celler njure benmärg som består av en blandad befolkning av njur-och hematopoetisk prekursorer, visar vi att nefronet stamceller kan ympas och differentierar till nya njurvävnad - guldmyntfoten av cellbaserade regenerativ terapi. Denna teknik kan anpassas för att leverera renade stamceller eller progenitorceller och / eller små molekyler till njuren samt andra inre organ och förbättrar zebrafisk som en mångsidig modell för att studera regenerativ medicin.

Protocol

1. Konditionering av icke-transgena mottagare fisk.

1. Välj den största manliga fisk i systemet för transplantation.
2. Placera fisken i 0,02% Tricaine (pH 7) i ca 3 minuter eller tills det tar stopp simning, men inte så lång att hjärtat slutar slå.
3. Sätt bedövas fisken på en fuktig pappershandduk på en bänk.
4. Använd en nål spruta för att injicera 40 ug av gentamicin i 20 ul av vatten in i intraperitoneal hålighet av fisken. För nedsatt förnyelse studier, är detta steg viktigt för att framkalla en gynnsam miljö för ökad engraftment.
5. Lägg fisken tillbaka i systemet vatten för återvinning.
6. Fisken kan vara foglig och mycket känslig för externa stimuli såsom vibrationer. Efter 3 timmars återhämtning, behandla fisken med 25 gråa av gammastrålning.
7. Lägg fisken tillbaka in i systemet i 3 dagar utan mat före transplantation.

2. Beredning av progenitorceller givare märkt genetiskt med en fluorescerande markör (EGFP eller mCherry).

1. Strax före det kirurgiska ingreppet, förbereda givaren celler som skall transplanteras och hålla dem på is.
2. För nedsatt studier använder vi hela celler njure benmärg från Tg (cdh17: EGFP) transgen linje, som innehåller njur-och hematopoetiska progenitorceller. Dessa stamceller är genetiskt märkta och kommer bara att uttrycka EGFP om de ympas och differentierar till nedsatt epitelceller. Andra typer av märkta stamceller kan också användas, såsom Tg (SCL: EGFP) för hematopoetisk stamcellstransplantation eller TG (fli1a: EGFP) för angioblast stamfäder transplantationer.
3. Euthanize 3 vuxna transgen fisk genom att placera dem i 0,2% Tricaine i 5 minuter.
4. Använd en steriliserad rakblad för att ta bort huvud och svans, och dissekera sax för att göra en mittlinje snitt längs den ventrala sidan.
5. Enligt en stereoskopet, ta bort alla inre organ i kroppen hålighet inklusive simblåsa med pincett. Var noga med att inte ta bort njuren, som är ett platt och pigmenterad organ knutna till dorsala väggen i kaviteten.
6. Nästa, dissekera ut njuren från rygg vägg och placera den i ett 1,5 ml centrifugrör som innehåller 300 ul av kallt fosfatbuffert saltlösning kompletterad med 2% fetalt kalvserum (1X PBS / 2% FCS).
7. Använd en mortelstöt för att klippa njurarna tills det blir homogeniserad.
8. Placera en 40 um cell sil i en 50 ml Falcon rör och överför cellen lösningen på toppen av cellen sil, så att de lösa cellerna att tränga igenom till Falcon röret.
9. Använd mortelstöten för att försiktigt smeta den stora bitar av vävnad som finns kvar på silen att ytterligare bryta upp cellerna.
10. Lämna cellen lösningen i Falcon röret och tvätta silen med 1,2 ml 1X PBS / 2% FCS att samla in resterande celler från silen.
11. Överför cellen lösningen i ett nytt 1,5 ml rör och centrifugera vid 4 ° C vid 300 RCF i 5 minuter.
12. Tvätta cellpelleten med 1,5 ml 1X PBS / 2% FCS och föra den genom en ny sil för att filtrera bort klumpar av klibbiga celler och centrifugera igen.
13. Resuspendera cellpelleten i 200 ul 1X PBS / 2% FCS och överför till en PCR-rör.
14. Centrifugera PCR-röret (4 ° C, 300 RCF, 1 min) och ta bort de flesta av supernatanten.
15. Resuspendera cellerna i återstående supernatanten för att få en 2-5 uL slutlig volym och lagra den på is.
16. Slutlig cellulära avkastningen bör vara cirka 2 miljoner celler per njure.
17. Räkna antalet celler med en hemocytometer och justera koncentrationen till 5 x 10 ⁵ celler per ul.

3. Ladda cellen lösningen i en Hamilton spruta.

1. Skölj Hamilton sprutan med sterilt vatten 3 gånger.
2. Skölj sprutan med 75% etanol 3 gånger.
3. Skölj sprutan igen med 1X PBS / 2% FCS 3 gånger.
4. Sedan ladda sprutan med 1 ul av cell-lösning innehåller ungefär 5 x 10 ⁵ celler strax före injektion.

4. Transplantation av stamceller direkt i njurarna.

1. Bedöva betingade mottagaren fisken i 0,02% Tricaine i ca 3 minuter, eller tills fisken har slutat röra sig, men inte för lång att hjärtat slutar slå.
2. Enligt ett stereomikroskop, lägg fisken på en pappershandduk med huvudet mot vänster, ventrala sidan uppåt, för att torka bort det transplanterade sida.
3. Rulla sedan fisken över att exponera torkade sida.
4. Använda steriliserade pincett, ta bort skalor i regionen omedelbart posteriort om gälarna.
5. Gör en 1 cm lateralt snitt i detta område på mittlinjen med en skalpell samtidigt stabilisera vävnaden med pincett.
6. Med hjälp av pincett, utsätta vävnaden och samtidigt fortsätta att göra snittet djupt nogatt exponera huvudet njuren.
7. Om det finns en hel del blödningar som förhindrar visualisering av njuren, euthenize fisken och börja om med en annan mottagare fisk.
8. Medan nyfikna vävnaden öppen för att exponera huvudet njuren, injicera 1 uL av cellen lösning direkt in i huvudet njuren.
9. Då, samtidigt som nålen är hämtas, släpp pincett så att vävnaden faller tillbaka på plats för att förhindra läckage av det injicerade cellerna.
10. Håll ett Suturnålar med en nål förare och tränga sig igenom muskeln på varje sida av snittet.
11. Tie 2 knop och klipp av överskottet sutur. Endast en enda sutur behövs för en 1 cm snitt.
12. Placera fisken i fisk vatten innehållande 10 ppm Tricaine i 5 timmar för att ge fisk med en lugnande smärtlindrande effekt.
13. Placera fisken tillbaka in i systemet för återvinning med normal matning.
14. Efter 7-18 dagar av återhämtning, dissekera vi fisken och analysera engraftment nedsatt stamceller av levande EGFP fluorescens.

5. Representativa resultat:

Den övergripande strategin för transplantation illustreras i figur 1. För vår nedsatt studier är njurarna dissekeras och analyseras av EGFP fluorescens. Engraftment och differentiering av nedsatt stamceller upptäcks så tidigt som sju dagar efter transplantationen. Detta framgår av förekomsten av flera kluster av EGFP ⁺ nedsatt epitelceller (Figur 2). Genom 18 dagar efter transplantationen, upptäcker vi ett genomsnitt på 24 EGFP ⁺ nefroner, vilket tyder på att donatorn celler har bildat ny njure vävnad (Figur 3). För att visa långsiktiga engraftment, dissekerade vi en mottagare fisk 59 dagar efter transplantationen (Figur 4). Denna fisk hade många nefroner vid injektionsstället (röd pil) förutom multipla nefroner på avlägsna platser (vit pilspetsar), vilket tyder på att njurarna stamceller är flyttfåglar. Denna teknik är snabbare och mer effektivt jämfört med när cellerna sprutas in i omlopp via hjärtat, som tar cirka tre månader för att upptäcka engraftment.

Figur 1. Övergripande system av transplantation. Icke-transgena mottagare fisk bestrålas för att undertrycka avstötning av transplanterade celler. Tre dagar senare, är ett snitt på flanken av fisk och donator progenitorceller injiceras i utsatta huvudet njuren. Snittet är stängd med en sutur och fisk placeras tillbaka in i systemet för återvinning. Njurar Mottagarens fisk dissekeras vid senare tidpunkter och analyseras för engraftment och stamceller aktivitet.

Figur 2. Engraftment av stamceller efter sju dagar. Engraftment av nedsatt stamceller har upptäckts på den injicerade sidan av huvudet njuren på sju dagar efter transplantationen, som bestäms av förekomsten av kluster av EGFP ⁺ nedsatt epitelceller (infälld - förstorad bild).

Figur 3. Engraftment av stamceller efter 18 dagar Efter 18 dagar efter transplantationen, vi upptäcker ett genomsnitt på 24 EGFP ⁺ givare som härrör nefroner (infoga - förstorad bild av enskilda EGFP ⁺ nephrons)..

Figur 4. Engraftment och migration av stamceller efter 59 dagar. Vi fortsatte att upptäcka engraftment av stamceller långt efter transplantation, även efter 59 dagar (röd pil huvudet). Vid denna senare tidpunkt, är donator-derived nefroner upptäcktes på platser bort från injektionsstället (vita pilar), i linje med stamceller migration.

Discussion

Celltransplantation tekniker är avgörande för regenerativ studier och är den gyllene standarden test för att mäta aktiviteten stamceller. Här redovisar vi en metod för att transplantera celler direkt i njurarna av vuxna zebrafisk att bestämma stamceller och stamceller aktivitet. Detta förfarande innebär att göra ett snitt genom muskeln att utsätta huvudet njure, följt av injektion av celler direkt i njurarna. Snittet är stängt med en enda sutur och drivs fisk har en 90-100% överlevnad. I våra experiment, är engrafted nedsatt stamceller upptäckts i 80-100% av de transplanterade fisk med sju dagar efter transplantation. En begränsning med denna teknik är att snittet är nära dorsala aorta, som lätt kan spruckit av skalpell. Men när behärskar, kan graden av blödning reduceras till mindre än en procent. Vår metod skulle kunna anpassas för att ge andra celltyper (blod, stromaceller eller vaskulär) samt små molekyler till njuren. Utvecklingen av denna teknik kommer att hjälpa förväg regenerativ studier och tillåta stam och stamceller potential som ska bedömas in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insulin syringe needle (28 gauge)	BD Biosciences	329461
Cell strainer (40 uM)	BD Biosciences	352340
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Hamilton syringe (26 gauge)	Sigma-Aldrich	20734
Ethilon suture (size 9-0)	Ethicon Inc.	2819G