زرع الخلايا مباشرة في الكلى من اسماك الزرد الكبار

Summary

زرع الخلايا هو تقنية أساسية لدراسة تجديد الأنسجة والخلايا لتطوير علاجات تعتمد على المرض. نظهر هنا تقنية المجهرية التي تسمح زرع الخلايا المسمى وراثيا مباشرة في الكلى للأسماك الزرد الكبار.

Abstract

الطب التجديدي استنادا إلى زرع خلايا جذعية أو السلف في الأنسجة التالفة لديه القدرة على معالجة مجموعة واسعة من الأمراض المزمنة ^1. ومع ذلك ، فإن معظم الأجهزة لا يمكن الوصول إليها بسهولة ، مما يستدعي الحاجة لتطوير أساليب جراحية للوصول إلى هذه الهياكل. في هذه المقالة الفيديو ، ونحن تصف طريقة لزرع الخلايا مباشرة في الكلى من الزرد الكبار ، وهذا نموذج لدراسة تجديد شعبية والمرض ^2. هي السمك قبل المتلقي مكيفة بواسطة أشعة لقمع الرفض المناعي للخلايا حقن ^3. نظهر كيف يمكن أن يتعرض الكلى رأسه شق الجانبي في الجهة من الأسماك ، تليها حقن الخلايا مباشرة في الجهاز. fluorescently المسمى باستخدام نخاع الكلى كلها خلايا تتألف من مزيج من السلائف والكلى للدم ، وتبين لنا أن أسلاف نفرون يمكن تدبر وتفرق في نسيج الكلى الجديد -- أي معيار الذهب من العلاج بالخلايا القائم على التجدد. ويمكن تكييف هذه التقنية لتوفير تنقية الخلايا الجذعية أو السلف و / أو الجزيئات الصغيرة في الكلى وكذلك الأعضاء الداخلية الأخرى ، ويعزز من الزرد كنموذج تنوعا لدراسة الطب التجديدي.

Protocol

1. تكييف الأسماك المتلقية غير المحورة جينيا.

1. حدد أكبر الأسماك الذكور في نظام الزرع.
2. ضع السمك في Tricaine 0.02 ٪ (الرقم الهيدروجيني 7) لحوالي 3 دقائق أو حتى أنه توقف عن السباحة ، ولكن لم يمض وقت طويل حتى أن القلب يتوقف عن الضرب.
3. وضع الأسماك تخدير على منشفة ورقية مبللة على قمة مقاعد البدلاء.
4. استخدام حقنة الانسولين إبرة لحقن 40 ميكروغرام من الجنتاميسين في 20 ماي من الماء في تجويف داخل الصفاق من الأسماك. التجديد للدراسات كلوي ، هذه الخطوة مهمة لتحفيز بيئة مواتية لتعزيز engraftment.
5. وضعت السمكة في الماء مرة أخرى لاستعادة النظام.
6. قد تكون سهلة الانقياد للأسماك وحساسة جدا لحافز خارجي مثل الاهتزاز. بعد 3 ساعات من الانتعاش ، ومعالجة الأسماك الرمادي مع 25 من أشعة غاما.
7. وضع الأسماك مرة أخرى في النظام لمدة 3 أيام من دون طعام قبل الزرع.

2. إعداد الخلايا المانحة السلف المسمى وراثيا مع علامة فلوري (EGFP أو mCherry).

1. فقط قبل العملية الجراحية ، وإعداد الخلايا المانحة إلى أن زرع والاحتفاظ بها في الجليد.
2. للدراسات الكلوي ، ونحن نستخدم كل خلايا نخاع الكلى من (cdh17 : EGFP) تيراغرام خط المعدلة وراثيا ، التي تحتوي على الخلايا الاصلية المكونة للدم والكلى. وصفت هذه الخلايا الاصلية وراثيا ، وسوف إلا أن نعرب عن EGFP إذا كانت تدبر وتفرق في الخلايا الظهارية الكلوية. ويمكن أيضا أنواع أخرى من الخلايا الاصلية المسمى استخدامها ، مثل تيراغرام (SCL : EGFP) للخلية الجذعية المكونة للدم أو تيراغرام (fli1a : EGFP) لزرع الأسلاف أرومة وعائية.
3. الموت ببطء الأسماك البالغة 3 المعدلة وراثيا عن طريق وضعها في Tricaine 0.2 ٪ لمدة 5 دقائق.
4. استخدام شفرة حلاقة معقم لإزالة الرأس والذيل ، ومقص تشريح لجعل شق خط الوسط على طول الجانب البطني.
5. تحت المجسام ، وإزالة كافة الأعضاء الداخلية في تجويف الجسم بما في ذلك السباحة مع ملاقط المثانة. يجب الحرص على عدم إزالة الكلى ، وهو هيئة مسطحة مصطبغة وتعلق على الجدار الظهري للتجويف.
6. المقبل ، من تشريح الكلى من الجدار الظهرية ووضعه في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل يحتوي على 300 UL المالحة الباردة الفوسفات عازلة تستكمل مع 2 ٪ مصل العجل الجنين (1X PBS FCS / 2 ٪).
7. استخدام مدقة إلى الكلى والقص حتى يصبح متجانس.
8. وضع 40 مصفاة أم خلية داخل أنبوب 50 مل فالكون ونقل الحل خلية في مصفاة رأس الخلية ، مما يسمح للخلايا فضفاضة لتصفية من خلال أنبوب إلى فالكون.
9. استخدام مدقة لتشويه برفق قطعة كبيرة من الأنسجة التي تم تركها في مصفاة أخرى لكسر تصل الخلايا.
10. ترك حل الخلية في أنبوب فالكون وغسل مصفاة مع 1.2 مل من 1X PBS FCS / 2 ٪ لجمع الخلايا المتبقية من المصفاة.
11. نقل حل الخلية في أنبوب جديد مل 1.5 و الطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 300 RCF لمدة 5 دقائق.
12. غسل بيليه الخلية مع 1.5 مل من 1X PBS FCS / 2 ٪ ، وتمريرها عبر مصفاة جديدة لتصفية كتل من الخلايا اللزجة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
13. Resuspend وبيليه في 200 خلية من UL من FCS 1X PBS / 2 ٪ ، ونقل إلى أنبوب PCR.
14. الطرد المركزي أنبوب PCR (4 درجات مئوية ، و 300 إطار التعاون الإقليمي ، 1 دقيقة) ، وإزالة معظم طاف.
15. Resuspend الخلايا في طاف المتبقية للحصول على الحجم النهائي 2-5 UL وتخزينها على الجليد.
16. ينبغي أن تسفر الخلوية النهائية ما يقرب من 2 مليون خلية في الكلى.
17. حساب عدد الخلايا مع عدادة الكريات وضبط تركيز إلى 5 × 10 ⁵ خلايا لكل UL.

3. تحميل حل الخلية إلى حقنة هاملتون.

1. شطف المحاقن المعقمة للمياه مع هاميلتون 3 مرات.
2. شطف المحاقن مع 75 ٪ من الإيثانول 3 مرات.
3. شطف حقنة مرة أخرى مع 1X PBS / 2 ٪ FCS 3 مرات.
4. ثم تحميل المحقنة مع 1 UL حل خلية تحتوي على ما يقرب من 5 × 10 ⁵ خلايا فقط قبل الحقن.

4. زرع الخلايا الاصلية مباشرة في الكلى.

1. تخدير الأسماك المستفيدة مكيفة في Tricaine 0.02 ٪ لمدة 3 دقائق ، أو حتى الأسماك توقف التحرك والضرب لم يمض وقت طويل جدا أن يتوقف القلب ولكن.
2. تحت stereomicroscope ، وضع السمك على منشفة ورقية مع رئيس باتجاه الجانب ، غادر بطني فوق ، من أجل تجفيف قبالة الجانب المزروع.
3. ثم لف السمك أكثر من لفضح الجانب المجففة.
4. استخدام ملاقط معقمة ، إزالة المقاييس في المنطقة الخلفية فورا إلى الخياشيم.
5. جعل شق 1 سم الوحشي في هذا المجال في خط الوسط مع مشرط حين استقرار النسيج مع ملاقط.
6. باستخدام الملقط ، وتعريض النسيج في الوقت الذي تواصل لجعل شق عميقة بما فيه الكفايةكشف رئيس الكلى.
7. إذا كان هناك الكثير من النزيف الذي يمنع من التصور الكلى ، euthenize السمك والبدء من جديد مع آخر الأسماك المستفيدة.
8. بينما التحديق في النسيج فتح لكشف الرأس الكلى ، وضخ 1 UL من الحل الخلية مباشرة في الرأس الكلى.
9. ثم ، في نفس الوقت الذي يتم استرداد إبرة حقنة ، والإفراج عن ملاقط بحيث يرتد الأنسجة في مكانها لمنع تسريب حقن الخلايا.
10. عقد إبرة خياطة مع سائق إبر وبيرس من خلال العضلات في كل جانب من الشق.
11. التعادل 2 عقدة ، وقطع الخيط الزائد. وهناك حاجة واحدة فقط للخياطة شق 1 سم.
12. ضع السمك في الماء السمك الذي يحتوي على 10 أجزاء في المليون من Tricaine لمدة 5 ساعات لتقديم السمك مع تأثير مهدئ مسكن.
13. ضع السمك مرة أخرى إلى نظام لاسترداد مع الرضاعة الطبيعية.
14. بعد أيام 7-18 من الانتعاش ، ونحن تشريح الأسماك وتحليل engraftment الخلايا الكلوية السلف التي مضان EGFP حية.

5. ممثل النتائج :

وتتجلى الاستراتيجية الشاملة للزراعة في الشكل 1. لدراساتنا الكلوي ، يتم تشريح الكلى وتحليلها بواسطة EGFP مضان. تم الكشف عن Engraftment وتمايز الخلايا الاصلية الكلوي في وقت مبكر إلى سبعة أيام بعد الزرع. هذا هو واضح من خلال وجود مجموعات متعددة من الخلايا الظهارية EGFP ⁺ كلوي (الشكل 2). زراعة بنسبة 18 يوما آخر ، اكتشفنا ما متوسطه 24 النيفرون ⁺ EGFP ، مشيرا إلى أن الجهات المانحة شكلت خلايا جديدة نسيج الكلى (الشكل 3). لشرح طويل الأجل engraftment ، ونحن تشريح سمكة المستلم زرع آخر 59 يوما (الشكل 4). وكان العديد من هذه السمكة النيفرون في موقع الحقن (رأس السهم الأحمر) بالإضافة إلى النيفرون متعددة في مواقع بعيدة (السهام البيضاء) ، مما يشير إلى أن الخلايا الكلوية السلف والمهاجرة. هذا الأسلوب هو أسرع وأكثر كفاءة مقارنة عندما يتم حقن الخلايا في الدورة الدموية عن طريق القلب ، والتي تأخذ ما يقرب من ثلاثة أشهر للكشف عن engraftment.

الشكل 1. والخطة الشاملة للإشعاع. زرع الأسماك المتلقي غير المعدلة وراثيا لقمع الرفض المناعي للخلايا المزروعة. تحقن بعد ثلاثة أيام ، يتم إجراء شق على الجناح من الأسماك والخلايا الاصلية المانحة في الكلى رئيس تتعرض لها. يتم إغلاق الشق مع واحد خياطة والسمك وتوضع مرة أخرى في النظام لتحقيق الانتعاش. يتم تشريح الكلى من الأسماك المتلقي في وقت لاحق نقطة وتحليلها لنشاط engraftment والسلف.

الشكل 2. Engraftment من الخلايا الاصلية بعد سبعة أيام. تم الكشف عن Engraftment الخلايا الكلوية السلف على الجانب حقنه في الكلى الرأس في سبعة أيام زرع آخر ، على النحو الذي تحدده وجود مجموعات من الخلايا الظهارية EGFP كلوي ⁺ (أقحم -- عرض مكبرة).

الشكل 3. Engraftment من الخلايا الاصلية بعد 18 يوما وبعد 18 يوما زرع آخر ، اكتشفنا ما متوسطه 24 EGFP ⁺ المانحة المستمدة النيفرون (إدراج -- عرض تضخيم الفردية النيفرون EGFP ^+).

الشكل 4. Engraftment وهجرة الخلايا الاصلية بعد 59 يوما. اصلنا engraftment للكشف عن الخلايا السلف لفترة طويلة بعد الزرع ، حتى بعد 59 يوما (أحمر الرأس السهم). عند هذه النقطة وقت لاحق ، تم الكشف عن الجهات المانحة وتستمد النيفرون في مواقع بعيدة عن موقع الحقن (أبيض رؤساء السهم) ، بما يتفق مع الهجرة الخلية السلف.

Discussion

تقنيات زرع الخلايا حاسمة للدراسات والتجدد هي فحص الذهب معيارا لقياس نشاط الخلايا الجذعية. هنا ، ونحن التقرير وسيلة لزرع خلايا مباشرة في الكلى من الزرد الكبار لتحديد السلف الجذعية ونشاط الخلايا. هذا الإجراء ينطوي على إجراء شق طريق العضلات لفضح الكلى الرأس ، تليها حقن الخلايا مباشرة في الكلى. مغلق مع خياطة الجرح واحد والسمك يعمل لديها معدل البقاء على قيد الحياة 90-100 ٪. في تجاربنا ، يتم الكشف عن الخلايا الاصلية engrafted الكلوي في 8-10 ٪ من الأسماك المزروعة من قبل سبعة أيام آخر الزرع. واحد الحد من هذه التقنية هو أن شق بالقرب من الأبهر الظهري ، والتي يمكن تمزق بسهولة بواسطة مشرط. ومع ذلك ، يتقن مرة واحدة ، يمكن خفض معدل النزيف إلى أقل من واحد في المئة. يمكن تكييفها لدينا وسيلة لتقديم أنواع الخلايا الأخرى (الدم وانسجة ، أو الأوعية الدموية) ، فضلا عن جزيئات صغيرة في الكلى. وسوف تطور هذه التقنية تساعد على التجدد ودراسات مسبقة تسمح بتقييم الجذعية والسلف المحتملة خلية في الجسم الحي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insulin syringe needle (28 gauge)	BD Biosciences	329461
Cell strainer (40 uM)	BD Biosciences	352340
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Hamilton syringe (26 gauge)	Sigma-Aldrich	20734
Ethilon suture (size 9-0)	Ethicon Inc.	2819G