La transplantation de cellules directement dans le rein de poisson zèbre adulte

Summary

La transplantation de cellules est une technique essentielle pour l'étude de la régénération des tissus et pour le développement des thérapies cellulaires de la maladie. Nous démontrons ici une technique microchirurgicale qui permet la transplantation de cellules génétiquement marquées directement dans le rein de poisson zèbre adulte.

Abstract

La médecine régénératrice basée sur la transplantation de cellules souches ou progénitrices dans les tissus endommagés a le potentiel de traiter un large éventail de maladies chroniques ^1. Cependant, la plupart des organes ne sont pas facilement accessibles, ce qui nécessite de développer des méthodes chirurgicales pour avoir accès à ces structures. Dans cet article, vidéo, nous décrivons une méthode de transplantation de cellules directement dans le rein de l'adulte poisson zèbre, un modèle populaire pour étudier la régénération et la maladie ^2. Poissons destinataire sont pré-conditionnées par irradiation pour supprimer le rejet immunitaire des cellules injectées ^3. Nous montrent comment la tête du rein peut être exposée par une incision dans le flanc latéral du poisson, suivi de l'injection des cellules directement dans l'organe. Utilisation entières marquées par fluorescence des cellules de moelle rein comprenant une population mixte de précurseurs hématopoïétiques et rénales, nous montrons que les progéniteurs néphron peut greffer et se différencier en tissu rénal nouvelle - la gancienne norme de toute thérapie à base de cellules régénératrices. Cette technique peut être adapté pour fournir souches purifiées ou des cellules progénitrices et / ou de petites molécules au rein, ainsi que d'autres organes internes et améliore encore le poisson zèbre comme modèle polyvalent pour étudier la médecine régénérative.

Protocol

1. Conditionnement du poisson bénéficiaire non-transgénique.

1. Sélectionnez le plus gros poisson mâle dans le système de transplantation.
2. Placer le poisson dans 0,02% tricaïne (pH 7) pendant environ 3 minutes ou jusqu'à ce qu'il s'arrête natation, mais pas aussi longtemps que le cœur cesse de battre.
3. Mettez le poisson anesthésié sur une serviette en papier humide sur une paillasse.
4. Utilisez une aiguille de seringue d'insuline à injecter 40 ug de gentamicine dans 20 uL d'eau dans la cavité péritonéale du poisson. Pour les études de régénération rénales, cette étape est importante pour induire un environnement favorable à la prise de greffe renforcée.
5. Mettez le poisson dans l'eau pour la récupération du système.
6. Le poisson peut être docile et très sensible aux stimuli externes tels que les vibrations. Après 3 heures de récupération, de traitement du poisson avec 25 gris de l'irradiation gamma.
7. Mettez le poisson dans le système pendant 3 jours sans nourriture avant la transplantation.

_title "> 2. Préparation de cellules donneuses génétiquement progénitrices marqué avec un marqueur fluorescent (EGFP ou mCherry).

1. Juste avant l'intervention chirurgicale, préparer les cellules du donneur à transplanter et de les garder sur la glace.
2. Pour les études rénales, nous utilisons l'ensemble des cellules de moelle rénaux de la Tg (cdh17: EGFP) lignée transgénique, qui contiennent des cellules souches hématopoïétiques et rénales. Ces cellules progénitrices sont génétiquement marqués et seulement exprimer EGFP s'ils se greffer et se différencient en cellules épithéliales rénales. D'autres types de cellules souches marquées peuvent également être utilisés, tels que Tg (scl: EGFP) sur les cellules souches hématopoïétiques ou Tg (fli1a: EGFP) pour les greffes de progéniteurs angioblastes.
3. Euthanasier 3 poissons adultes transgénique en les plaçant dans 0,2% tricaïne pendant 5 minutes.
4. Utilisez une lame de rasoir stérile pour enlever la tête et la queue, et la dissection des ciseaux pour faire une incision médiane le long de la face ventrale.
5. En vertu d'un stéréoscope,supprimer tous les organes internes dans la cavité du corps, y compris la vessie natatoire avec des pincettes. Veillez à ne pas retirer le rein, qui est un organe plat et pigmentée attaché à la paroi dorsale de la cavité.
6. Ensuite, disséquer les reins de la paroi dorsale et le placer dans un tube à centrifuger de 1,5 ml contenant 300 ul de solution saline de tampon phosphate froid additionné de 2% de sérum de veau fœtal (1X PBS / 2% FCS).
7. Utilisez un pilon pour cisailler les reins jusqu'à ce qu'elle devienne homogène.
8. Placer une crépine 40 pM cellule à l'intérieur d'un tube Falcon de 50 ml et transférer la solution de cellules au-dessus de la crépine cellule, ce qui permet aux cellules libres à filtrer dans le tube Falcon.
9. Utilisez le pilon en douceur les frottis de grands morceaux de tissus qui sont laissés sur le tamis de continuer à briser les cellules.
10. Laisser la solution de cellules dans le tube Falcon et laver le filtre avec 1,2 ml de PBS 1X / 2% FCS pour recueillir des cellules résiduelles provenant de l'épurateur.
11. Transférerla solution de cellules dans un nouveau tube de 1,5 ml et centrifuger à 4 ° C à 300 rcf pendant 5 minutes.
12. Laver le culot cellulaire avec 1,5 ml de PBS 1X / 2% de FCS et le passer à travers une passoire pour filtrer les nouveaux amas de cellules collantes et centrifuger à nouveau.
13. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 200 ul de PBS 1X de / 2% SVF et transférer dans un tube PCR.
14. Centrifuger le tube de PCR (4 ° C, 300 rcf, 1 min) et retirer la plupart de surnageant.
15. Reprendre les cellules dans le surnageant résiduel pour obtenir un volume de 2-5 uL finale et le stocker sur glace.
16. Finale rendement cellulaire devrait être d'environ 2 millions de cellules par les reins.
17. Compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre et ajuster la concentration de 5 x 10 ⁵ cellules par uL.

3. Chargez la solution de cellules dans une seringue Hamilton.

1. Rincer la seringue Hamilton avec de l'eau stérile 3 fois.
2. Rincer la seringue avec de l'éthanol à 75% 3 fois.
3. Rincer la SyriESN nouveau avec 1X PBS / 2% FCS 3 fois.
4. Puis charger la seringue avec 1 ul de solution de cellules contiennent environ 5 x 10 ⁵ cellules juste avant l'injection.

4. La transplantation de cellules souches directement dans le rein.

1. Anesthésier le poisson receveur conditionné dans 0,02% tricaïne pendant environ 3 minutes, ou jusqu'à ce que le poisson a cessé de bouger, mais pas trop longtemps que le cœur cesse de battre.
2. Sous un stéréomicroscope, mettez le poisson sur une serviette en papier avec la tête vers la gauche, jusqu'à la face ventrale, afin de sécher sur le côté transplanté.
3. Ensuite, enroulez le poisson pour exposer le côté séché.
4. L'aide de pinces stériles, enlever les écailles dans la région immédiatement postérieure aux branchies.
5. Faire une incision de 1 cm latérale dans ce domaine sur la ligne médiane avec un scalpel tout en stabilisant le tissu avec des pincettes.
6. Utiliser les pinces, exposer le tissu tout en continuant à faire l'incision assez profondepour exposer le rein antérieur.
7. S'il ya beaucoup de saignement qui empêche la visualisation du rein, euthenize le poisson et recommencer avec un autre poisson destinataire.
8. Tout en soulevant le tissu ouverte pour exposer la tête du rein, injecter 1 ul de la solution de cellules directement dans le rein tête.
9. Puis, en même temps que l'aiguille de la seringue est en cours de récupération, de libérer la pince de telle sorte que le tissu retombe en place pour empêcher une fuite des cellules injectées.
10. Tenir une aiguille de suture avec un entraînement d'aiguille et la percer à travers le muscle de chaque côté de l'incision.
11. Attachez 2 noeuds et couper le fil de suture excès. Seule une suture simple est nécessaire pour une incision de 1 cm.
12. Placer le poisson dans de l'eau contenant des poissons 10 parties par million de tricaïne de 5 heures pour produire un poisson avec un effet calmant analgésique.
13. Placer le poisson dans le système de récupération des tétées normales.
14. Après 7-18 jours de reprise, nous disséquer et d'analyser les poissons engraftment de cellules progénitrices rénales par fluorescence EGFP en direct.

5. Les résultats représentatifs:

La stratégie globale de la transplantation est illustré à la figure 1. Pour nos études rénales, le rein est disséqué et analysé par fluorescence EGFP. La prise de greffe et la différenciation des cellules progénitrices rénales est détectée dès sept après la greffe jours. Cela est évident par la présence de plusieurs groupes de EGFP ⁺ cellules épithéliales rénales (Figure 2). À 18 ans après la greffe jours, nous détectons une moyenne de 24 EGFP ⁺ néphrons, ce qui indique que les cellules du donneur ont formé du tissu nouveau rein (Figure 3). Pour démontrer greffe à long terme, nous avons disséqué un poisson receveur après la greffe 59 jours (figure 4). Ce poisson a eu beaucoup de néphrons au site d'injection (rouge tête de flèche), en plus de plusieurs néphrons sur des sites distants (flèches blanches), ce qui suggère que les cellules progénitrices rénales sont des oiseaux migrateurs. Cette technique est plus rapide d'une plus efficace par rapport à quand les cellules sont injectées dans la circulation par le cœur, ce qui prend environ trois mois pour détecter la prise de greffe.

Figure 1. Diagramme d'ensemble de la transplantation. Poisson receveur non-transgénique sont irradiés pour supprimer le rejet immunitaire des cellules transplantées. Trois jours plus tard, une incision est pratiquée sur le flanc du poisson et des donneurs de cellules souches sont injectées dans le rein tête exposée. L'incision est refermée avec une suture et les poissons sont placés dans le système de récupération. Reins des poissons destinataire sont disséqués à des temps plus tardifs et analysés pour la prise de greffe et de l'activité géniteur.

Figure 2. La prise de greffe de cellules souches après sept jours. La prise de greffe de cellules souches rénales est détectée sur le côté injectédu rein tête à sept heures après la transplantation jours, tel que déterminé par la présence d'amas de EGFP ⁺ cellules épithéliales rénales (en médaillon - vue agrandie).

Figure 3. Prise de greffe de cellules souches après 18 jours Après 18 jours après la transplantation, nous avons détecté une moyenne de 24 ⁺ EGFP donateurs issus de néphrons (insert - vue agrandie de chaque EGFP ⁺ néphrons)..

Figure 4. La prise de greffe et la migration des cellules progénitrices après 59 jours. Nous avons continué à détecter la prise de greffe de cellules souches longtemps après la transplantation, même après 59 jours (tête de flèche rouge). A ce stade, plus tard, des bailleurs de fonds issus de néphrons sont détectés sur des sites en dehors du site d'injection (têtes de flèches blanches), conformément à la migration des cellules progénitrices.

Discussion

Les techniques de transplantation de cellules sont cruciales pour les études de régénération et le dosage sont l'étalon-or pour mesurer l'activité des cellules souches. Ici, nous présentons une méthode de transplantation de cellules directement dans le rein du poisson zèbre adulte pour déterminer tige et l'activité des cellules progénitrices. Cette procédure consiste à faire une incision à travers le muscle pour exposer le rein tête, suivie de l'injection de cellules directement dans le rein. L'incision est fermée par un fil de suture unique et le poisson à commande ont un taux de survie 90-100%. Dans nos expériences, greffées des cellules progénitrices rénales sont détectés dans 80-100% des poissons transplantés par sept après la transplantation jours. Une limitation de cette technique est que l'incision est proche de l'aorte dorsale, qui peut être facilement rompue par le scalpel. Cependant, une fois maîtrisé, le taux de saignement peut être réduite à moins de un pour cent. Notre méthode pourrait être adapté pour fournir d'autres types cellulaires (sang, du stroma, ou vasculaire) ainsi que de petites moléles au rein. Le développement de cette technique aidera les études préalables de régénération et de permettre à la tige et le potentiel de cellules souches à évaluer in vivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Insulin syringe needle (28 gauge)	BD Biosciences	329461
Cell strainer (40 uM)	BD Biosciences	352340
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040
Hamilton syringe (26 gauge)	Sigma-Aldrich	20734
Ethilon suture (size 9-0)	Ethicon Inc.	2819G