Summary
光学分辨率的光声显微镜（或PAM），是一种新兴技术，成像光吸收能力对比
Abstract
光学显微镜，在细胞和细胞器水平提供有价值的见解，已被广泛认可，作为一个有利的生物医学技术。由于三维（3 - D） 在体内的光学显微镜，single-/multi-photon荧光显微镜和光学相干断层扫描（OCT）已证明其非凡的灵敏度荧光和光散射对比，分别支柱。然而，生物组织，其中重要的生理/病理信息进行编码，的光吸收对比尚未被课税。
生物医学photoacoustics的出现，导致了光学显微镜的光学分辨率的光声显微镜（或- PAM），1光的照射下，其中的重点是实现蜂窝1或2级甚至亚细胞横向分辨率的衍射极限的一个新的分支。作为一个有价值的补充，现有的光学显微镜技术，OR - PAM的带来了至少两个新奇。首先和最重要的是，OR - PAM的检测光吸收对比，具有非凡的灵敏度（即100％）。 3荧光显微镜或光散射基于10月4日 （或同时）或- PAM的结合，提供全面的生物组织的光学性质。第二，OR - PAM编码成声波的光吸收，相反，在荧光显微镜和华侨城纯光学过程，并提供背景，免费检测。或PAM的声波探测减轻光散射信号衰减的影响和自然消除可能干扰之间的激发和检测，这是由于激发光谱和荧光光谱之间的重叠，在荧光显微镜常见的问题（即串扰）。
OR - PAM的独特的光吸收成像，已经证明其发明以来广泛的生物医学应用，包括但不限于，神经病学5，6，7眼科，8，9血管生物学和皮肤病10。在这段视频中，我们教系统的OR - PAM的配置和调整，以及在体内功能微血管成像实验程序。
Protocol
1。系统配置
- 光照射
- 光照射源：二极管泵浦固态激光脉冲（INNOSLAB，Edgewave）和一个染料激光器（CBR - D Sirah）。
- 输出的激光束（脉冲宽度：7 NS）的重点是通过聚光镜（LA1131，Thorlabs）传递通过一个50微米的小孔（P50C，Thorlabs）。
- 针孔的位置，从稍远的聚光镜的焦点相匹配的有效的空间滤波的基本模式的光束直径的针孔的直径。
- 过滤后的光束衰减是一个中性密度过滤器（NDC - 50C - 2M，Thorlabs）和耦合到单模光纤（P1 - 460A - FC - 2，Thorlabs）。
- 光纤输出填补显微镜的目标回光圈（RMS4X，Thorlabs）达到衍射极限〜2.6微米的光集中在570 nm波长。
- 超声检测
- 超声换能器：50 - MHz的中心频率（V214 - BB - RM，奥林巴斯NDT）。
- 超声换能器，超声波检测，这是符合衍射极限的光学照射同轴连接到自制的声光光束合成 11 。
- 一个球形空腔地面合成底部产生声学透镜。这种声学透镜在水中的数值孔径为0.5，并在50 MHz的中心频率，给出了一个声学直径43微米的焦点。
- confocally，以最大限度地提高检测灵敏度的光学和声学重点是一致的。
- 声学耦合
- 干式超声耦合是避免淹没在水中的动物实验，这是在早期的光声成像系统12。
- 成像窗口中打开培养皿（直径9厘米）的底部，并用超声波和光学透明的聚乙烯膜密封。
- （图像清晰，SonoTech）之间的聚乙烯膜和对象所产生的光声波从对象到培养皿中，和去离子水的培养皿中进一步夫妇波的淹没或PAM的成像头成像夫妇的超声波凝胶。
- 电子
- 超声换能器检测到的光声信号放大由两个级联的放大器（ZFL 500LN，Mini - Circuits公司）
- 放大后的信号是数字化的14位数据采集（DAQ）板在200 MS / s的采样率（CompuScope 14200，量具应用科学）
- 扫描计划
- 二维（2 - D）OR - PAM的成像头沿水平（XY）平面光栅扫描控制由一台个人电脑，这将触发DAQ板卡和泵浦激光器。从DAQ板的时钟信号同步的触发信号。
- 快轴的2 - D扫描仪定义为横断面扫描（B扫描）的方向。
- B -扫描图像序列可以获取翻译沿慢轴成像头，形成一个体积的形象，这可以被视为直接的3 - D渲染，或在一个2 - D最大振幅预测（MAP）图像。
2。系统校准
- 使用脉冲回波超声和超声波的反射来确定声焦平面的位置（即最大的超声波脉冲回波信号触发信号的时间延迟）。这一步是必需的，要建设或PAM系统时，只执行一次。
- 单模光纤的耦合效率最大化。
- 应用超声波凝胶的光学吸收的对象（例如，一块黑胶带）上，并轻轻重视下成像窗口充满去离子水的培养皿中。
- 下入水成像头，并删除声学透镜下的气泡。
- 调整成像头，直到吸收对象的光声信号从声焦平面，可以从声波延迟判断。
- 调整显微镜物镜的垂直位置（即Z位置），以最大限度地从平面物体产生的光声信号的振幅。最大化的信号幅度表明，光的重点是在垂直方向的声重点相一致。
- 调整显微镜物镜的水平位置（即x和y位置），直到从目标产生的光声信号，显示了对称格局。对称性表明，光的重点是在水平方向的声重点相一致。
- 重复步骤2.6和2.7，直到光声信号是对称和幅度都进行了优化。
3。阿sa mple实验过程在体内或- PAM的小鼠耳廓血管
- 这一步是不需要裸鼠 。麻醉动物腹腔注射鸡尾酒[配方：氯胺酮（100毫克/毫升）1毫升，0.1毫升甲苯噻嗪（100毫克/毫升）和8.9 ml生理盐水;用量：0.1 ml/10 G]。剃须在耳后的头发，并进一步脱毛Surgi霜（＃：82565类别，美国国际实业）用去离子水清洗前残留的头发。请注意，如脱毛可能会略有刺激皮肤血管，因而是最好的执行计划实验前24小时。
- 打开光声激光系统，并检查系统对齐。
- 麻醉吸入气体（典型的流量是1.0-1.5升/分钟，根据动物的体重）3％异氟醚蒸发鼠标，保持整个实验过程中，用1％异氟醚麻醉。医疗级空气吸入气体维持在正常生理状态的鼠标建议。
- 鼠标转移到一个立体阶段，并控制其体温在37 ° C加热垫。
- 小鼠耳廓上的塑料板拼合，适用于耳上的超声凝胶层。避免被困里面的凝胶气泡。然后，将耳下成像窗口和超声凝胶接触的聚乙烯膜的底部慢慢抬高，直到动物阶段。软接触是必要的，因为膜贴着耳朵，可能会影响耳血流量。
- 钳脉搏血氧仪，鼠标的腿或尾巴，监测其生理状态，适用于软膏的眼睛，以防止干燥和意外激光鼠标眼睛的损害。
- 下声学透镜成像头，直到去离子水浸泡，并删除声学透镜下的气泡。
- 激光能量密度检查，以确保它在激光安全标准是美国国家标准学会13。激光能量密度不应超过20兆焦耳/厘米2，到80时重点是皮肤表面的下方，在150微米的激光束的激光脉冲能量NJ 。
- 设置激光外部触发模式，并开始试扫描。直到最强的光声信号从声焦平面成像头的Z位置调整。
- 正确的扫描参数设置，并开始正式的图像采集。
- 实验后，关闭激光，解除成像头去离子水，降低动物的阶段，释放鼠标，清洁与去离子水的小鼠耳，关闭麻醉系统和温度控制器，和卸载鼠标从立体定向阶段。
- 如果需要重复成像，孵化器在鼠标与环境温度在37 ° C。返回鼠标的动物设施后自然醒来。否则，按照协议euthanatize和处置动物。
4。功能或PAM的总浓度和血红蛋白的氧饱和度
- 氧合血红蛋白（HBO 2） 和脱氧血红蛋白（HBR）是血红蛋白的两种主要形式，在可见光谱范围内的主要内源性的光声源。 HBO 2和HBR有不同的吸收光谱，从而可以光谱区别量化的总浓度（HBT）和血氧饱和度（SO 2）血红蛋白5。这里有两个准则，以帮助选择适当的光波长，所以测量：
- 波长应选择内的血红蛋白的吸收光谱（即550-600纳米）的Q带，以确保足够的信号噪声比和充分的渗透。
- HBO 2和HBr的吸收系数有明显的差异（例如，HBR主导的561 nm和HBO 2主导的578纳米）的波长建议。
除了SO 2，HBT可以计算加入HBR]和[HBO 2]在一起，或者也可以直接测量血红蛋白的摩尔消光系数的光谱（例如，530纳米，545纳米，570纳米，和的isosbestic波长584纳米）14，其中2 HBR和HBO有平等的摩尔消光系数。
5。代表性的成果：
在图1所示的血管解剖和SO 2裸鼠生活在一个由双波长（561和570 nm处）或- PAM的成像耳朵。典型的双波长图像采集时间，所以这样一个感兴趣的区域进行测量（图像尺寸：10毫米× 10毫米;步长：2.5微米× 5微米）〜 80分钟。
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图1 在体内的光学分辨率的光声显微镜。 （一）总血红蛋白浓度显示血管解剖（在570 nm处获得）和（二）血红蛋白氧饱和度（在561 nm和570 nm处获得）在裸小鼠耳的地图图像。 （三）在面板的盒装地区（一）特写。在面板的规模巴（a）适用于上述（a）及（B）。
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Discussion
在这段视频中，我们提供了一个OR - PAM的实验方案，包括系统配置，系统校准，典型的实验程序的详细说明。无标签，无创或PAM，使微血管功能和单一的毛细血管基础代谢的研究，从而有潜力，扩大我们的微循环相关的生理和病理的认识。 Microphotoacoustics是目前制造这样或PAM系统。
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Disclosures
符合所有实验动物的程序进行，由学校在圣路易斯华盛顿大学医学院动物研究委员会批准的协议实验室动物。
Acknowledgments
作者欣赏Lynnea Brumbaugh博士的仔细阅读的手稿。这项工作是由国家卫生赠款R01 EB000712，R01 EB008085，R01 CA134539，U54 CA136398和5P60 DK02057933研究院赞助。丽红五，王教授已在Microphotoacoustics，公司和恩德拉号，公司，金融利益，但不支持这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Home-made acoustic-optical beam combiner: | |||
| right-angle prism | Edmund Scientific | NT32-545 | |
| rhomboid prism | Edmund Scientific | NT49-419 | |
| silicone oil | Clearco Products | 1000cSt | |
| OR-PAM system | Microphotoacoustics | ||
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