Summary
Óptico com resolução de microscopia fotoacústica (OR-PAM) é uma tecnologia emergente capaz de imagem absorção óptica contrastes
Abstract
Microscopia óptica, fornecendo informações valiosas a nível celular e organelas, tem sido amplamente reconhecida como uma tecnologia que permite biomédica. Como os principais pilares da in vivo tridimensional (3-D) microscopia óptica, microscopia de fluorescência single-/multi-photon e tomografia de coerência óptica (OCT) têm demonstrado a sua sensibilidade a contrastes extraordinários de fluorescência e de espalhamento óptico, respectivamente. No entanto, o contraste de absorção óptica dos tecidos biológicos, que codifica a informação fisiológica / patológica essencial, ainda não foi avaliável.
O surgimento de photoacoustics biomédica levou a um novo ramo da microscopia óptica, microscopia óptica resolução fotoacústica (OR-PAM) 1, onde a irradiação óptica é voltado para o limite de difração para alcançar um celular ou resolução mesmo nível subcelular duas laterais. Como um complemento valioso para as tecnologias existentes microscopia óptica, OR-PAM traz em pelo menos duas novidades. Primeiro e mais importante, OR-PAM detecta contrastes absorção óptica com extraordinária sensibilidade (ou seja, 100%). Combinando OR-PAM com microscopia de fluorescência com 3 ou óptico-espalhamento baseado 04 de outubro (ou com ambos) fornece abrangente propriedades ópticas dos tecidos biológicos. Segundo, OR-PAM codifica absorção óptica em ondas acústicas, em contraste com os processos de pura óptica em microscopia de fluorescência e outubro, e fornece fundo sem detecção. A detecção acústica em OR-PAM reduz os impactos da dispersão óptica em degradação de sinal e, naturalmente, elimina as interferências possíveis (ou seja, crosstalks) entre a excitação e detecção, que é um problema comum em microscopia de fluorescência devido à sobreposição entre os espectros de excitação e de fluorescência.
Único para a imagem latente de absorção óptica, OR-PAM demonstrou ampla aplicações biomédicas desde sua invenção, incluindo, mas não limitado a, neurologia 5, 6, oftalmologia 7, 8, biologia vascular 9 e 10 de dermatologia. Neste vídeo, nós ensinamos a configuração do sistema e alinhamento de OR-PAM, bem como os procedimentos experimentais para a imagem in vivo microvascular funcional.
Protocol
1. Configuração do sistema
- Irradiação óptica
- Fonte de radiação óptica: um diodo-bombeada de estado sólido pulsado laser (INNOSLAB, Edgewave) e um laser de corante (CBR-D, Sirah).
- A saída do feixe laser (largura de pulso: 7 ns) é focalizado por uma lente condensadora (LA1131, Thorlabs) para passar através de uma pinhole 50 mícrons (P50C, Thorlabs).
- O pinhole é posicionado um pouco longe do foco da lente condensadora para coincidir com o diâmetro pinhole com o diâmetro do feixe fundamentais de modo eficaz para a filtragem espacial.
- O feixe filtrado é atenuado por um filtro de densidade neutra (NDC-50C-2M, Thorlabs) e, em seguida, acoplada em uma fibra óptica monomodo (P1-460A-FC-2, Thorlabs).
- A saída de fibra enche a abertura traseira de uma objetiva de microscópio (RMS4X, Thorlabs) para atingir um foco de difração limitada óptica de ~ 2,6 mM no comprimento de onda de 570 nm.
- Detecção ultra-sônica
- Transdutor de ultra-som: 50-MHz centrais freqüência (V214-BB-RM, Olympus-NDT).
- O transdutor de ultra-som é acoplado a um home-made combinador de feixe acústico-ótico 11 para detecção ultra-sônica, que está alinhada coaxialmente com a irradiação de difração limitada óptica.
- Uma cavidade esférica é um terreno fora do fundo do combinador para produzir uma lente acústica. Esta lente acústica tem uma abertura numérica de 0,5 em água e dá um diâmetro acústico focal de 43 mM na freqüência central de 50 MHz.
- Os focos visuais e acústicos estão alinhados confocally para maximizar a sensibilidade de detecção.
- Acoplamento acústico
- Acoplamento ultra-sônico seca é empregada para evitar a submersão em água animais experimentais, que foi utilizado no início de sistemas de imagem fotoacústica 12.
- Uma janela de imagem é aberta no fundo de uma placa de Petri (9 cm de diâmetro) e é selado com uma membrana de polietileno de ultra-som e opticamente transparentes.
- Gel ultra-sônico (Image Clear, SonoTech) entre a membrana de polietileno e do objeto a ser fotografado casais a onda gerada fotoacústica do objeto para a placa de Petri, e água deionizada na placa de Petri casais ainda mais a onda até a cabeça submersa imagem OR-PAM .
- Eletrônica
- O sinal fotoacústico detectada pelo transdutor de ultra-som é amplificado por dois amplificadores em cascata (ZFL 500LN, Mini-Circuits)
- O sinal amplificado é digitalizada por uma aquisição de dados 14-bit (DAQ) bordo (CompuScope 14200, Gage Ciências Aplicadas) a uma taxa de amostragem de 200 MS / s.
- Digitalização esquema
- Bidimensional (2-D) de varredura da cabeça de digitalização de imagens OR-PAM ao longo do plano (xy) horizontal é controlada por um computador pessoal, o que desencadeia tanto na placa DAQ eo laser da bomba. O sinal de disparo é sincronizado com o sinal de clock-out da placa DAQ.
- O eixo rápido do scanner 2-D é definida como a direção da varredura transversal (B-scan).
- Uma seqüência de B-scan imagens podem ser adquiridas por traduzir a imagem de cabeça ao longo do eixo lento para formar uma imagem volumétrica, que pode ser visto tanto em uma renderização 3-D direta ou em uma projeção 2-D amplitude máxima (MAP) de imagem .
2. Alinhamento do sistema
- Use pulso-eco ultra-som e um refletor ultra-som para determinar a posição do plano focal acústica (ou seja, o tempo de atraso do sinal de gatilho para o sinal de pulso-eco ultra-som no máximo). Este passo é necessário para ser realizada apenas uma vez quando a construção do sistema de OR-PAM.
- Maximizar a eficiência de acoplamento da fibra monomodo.
- Aplique gel ultra-som em cima de um objeto opticamente absorvente (por exemplo, um pedaço de fita preta) e anexá-lo delicadamente debaixo da janela de imagem em placa de Petri com água deionizada.
- Baixar a cabeça de imagens na água, e remover as bolhas de ar presas sob a lente acústica.
- Ajustar a cabeça de imagem até que o sinal fotoacústico do objeto absorver é a partir do plano focal acústico, que pode ser julgado a partir do atraso acústico.
- Ajustar a posição vertical (ou seja, a posição z) da objetiva do microscópio para maximizar a amplitude do sinal fotoacústico gerado a partir do objeto plano. A amplitude do sinal maximizada sugere que o foco óptico está alinhado com o foco acústica na direção vertical.
- Ajustar as posições horizontal (posições ou seja, x, y) da objetiva do microscópio até que o sinal fotoacústico gerado a partir do destino mostra um padrão simétrico. A simetria sugere que o foco óptico está alinhado com o foco acústica na direção horizontal.
- Repita os passos 2.6 e 2.7 até que o sinal fotoacústico é otimizado em ambos os simetria e amplitude.
3. A sa procedimento experimental mple-in vivo OR-PAM do mouse ouvido vasculatura
- Esta etapa não é necessária para ratos nude. Anestesiar o animal com uma injeção intraperitoneal de um cocktail [receita: 1 ml de ketamina (100 mg / ml), 0,1 ml de xilazina (100 mg / ml), e 8,9 ml de soro; dosagem: 0,1 ml/10 g]. Raspar o cabelo no ouvido, e ainda depilar os cabelos residual com Surgi Cream (Categoria #: 82565, American International Industries) antes de limpá-lo com água deionizada. Note-se que tais depilação pode irritar um pouco a vascularização da pele e, assim, é melhor realizada 24 horas antes do experimento planejado.
- Ligue o sistema a laser fotoacústica, e verificar o alinhamento do sistema.
- Anestesiar o rato com 3% de isoflurano vaporizado pelo gás inalação (a taxa de fluxo típico é 1,0-1,5 l / min, dependendo do peso corporal do animal), e manter a anestesia com isoflurano a 1% durante todo o experimento. Médico-grade do ar é recomendada como o gás de inalação para manter o mouse no estado fisiológico normal.
- Transferir o mouse para um estágio estereotáxica, e controlar a sua temperatura corporal a 37 ° C com uma almofada de aquecimento.
- Achatar o ouvido do rato sobre uma placa de plástico e aplique uma camada de gel de ultra-som em cima da orelha. Evite bolhas de interceptação no interior do gel. Em seguida, coloque o ouvido na janela de imagem e lentamente eleve a fase animal até os contatos de ultra-som gel na parte inferior da membrana de polietileno. De contato gelatinosas é necessário porque pressionar a orelha contra a membrana pode afetar o fluxo de sangue no ouvido.
- Pinça um oxímetro de pulso para a perna do mouse ou a cauda para monitorar seu estado fisiológico e aplique pomada para os olhos para evitar ressecamento e danos acidentais a laser para os olhos mouse.
- Baixar a cabeça de imagens até a lente acústica é imerso em água deionizada, e remover as bolhas de ar presas sob a lente acústica.
- Verificar a influência do laser para se certificar de que está dentro dos padrões de laser de segurança da American National Standards Institute 13. A influência do laser não deve exceder 20 mJ / cm 2, que se traduz em 80 nJ de laser de pulso de energia quando o feixe de laser é focado em 150 M abaixo da superfície da pele.
- Definir a laser para o modo de external-gatilho e começar a digitalizar julgamento. Ajustar a posição z da cabeça de imagem até o mais forte sinal fotoacústico é a partir do plano focal acústico.
- Conjunto correto parâmetros de digitalização e começar a aquisição de imagem formal.
- Após a experiência, desligue o laser, levante a cabeça de imagem para fora da água deionizada, menor o estágio animal para soltar o mouse, limpar o ouvido do rato com água deionizada, desligue o sistema de anestesia eo controlador de temperatura, e descarregar o mouse desde a fase de estereotáxica.
- Se imagens repetitivas é necessário, coloque o mouse em uma incubadora com a temperatura ambiente a 37 ° C. Devolver o mouse para a instalação de animais depois que acorda naturalmente. Caso contrário, siga os protocolos animal Eutanásia e descartá-la.
4. Funcional ou-PAM de concentração total e saturação de oxigênio da hemoglobina
- Oxihemoglobina (HBO 2) e desoxihemoglobina (HBR) são as duas principais formas de hemoglobina, a fonte endógena fotoacústica predominante na faixa visível do espectro. HbO 2 e HBR têm espectros de absorção óptica distinta e, portanto, podem ser espectralmente diferenciadas para quantificar tanto a concentração total (HBT) e saturação de oxigênio (SO 2) de hemoglobina 5. Aqui estão duas diretrizes para ajudar a selecionar comprimentos de onda ópticos adequada para o SO 2 medidas:
- Comprimentos de onda deve ser selecionado dentro do Q banda do espectro de absorção da hemoglobina (ou seja, 550-600 nm) para garantir uma relação sinal-ruído suficiente e uma penetração adequada.
- Comprimentos de onda onde os coeficientes de absorção da HBO 2 e HBR tem uma diferença acentuada (por exemplo, HBR-561 nm dominante e HBO 2-dominante 578 nm) são recomendados.
Além de SO 2, HBT pode ser calculado pela adição [HBR] e [HbO 2] juntos, ou ele pode ser medido diretamente em comprimentos de onda do espectro isosbestic extinção molar coeficiente de hemoglobina (por exemplo, 530 nm, 545 nm, 570 nm, e 584 nm) 14, onde HBR e HBO 2 têm iguais coeficientes de extinção molar.
5. Resultados representativos:
Mostrado na Figura 1 é a anatomia vascular e sO 2 em uma orelha de rato vivo nua fotografada pela dupla de comprimento de onda (561 e 570 nm) OR-PAM. O tempo de aquisição típicos imagem para comprimento de onda duplo para duas medições de uma região de interesse (tamanho da imagem: 10 mm x 10 mm; tamanho do passo: 2,5 M x 5 mm) é de aproximadamente 80 min.
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Figura 1. Em microscopia óptica com resolução vivo fotoacústica. Imagens MAP de (A) a concentração de hemoglobina total mostrando a anatomia vascular (adquirida a 570 nm) e (B) a saturação de oxigênio da hemoglobina (adquirida em 561 nm e 570 nm) em uma orelha do camundongo nude. (C) Close-up da região encaixotado no painel (A). A barra de escala no painel (A) aplica-se tanto (A) e (B).
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Discussion
Neste vídeo, nós fornecemos um instruções detalhadas sobre os protocolos experimentais de OR-PAM, incluindo configuração do sistema, alinhamento do sistema, e típica procedimentos experimentais. PAM OR-label-free, não-invasivo tem permitido estudos de funcionamento microvascular e metabolismo em uma base única capilar e, portanto, tem potencial para expandir nossa compreensão da microcirculação relacionados com fisiologia e patologia. Microphotoacoustics já está fabricando este sistema OR-PAM.
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Disclosures
Todos os procedimentos experimentais em animais foram realizados em conformidade com o protocolo de animais de laboratório aprovado pela Escola de Medicina de Animais Estudos Comité de Washington University em St. Louis.
Acknowledgments
Os autores agradecem leitura atenta Dr. Lynnea Brumbaugh do manuscrito. Este trabalho foi patrocinado pelo National Institutes of Health Grants EB000712 R01, R01 EB008085, R01 CA134539, U54 CA136398 e 5P60 DK02057933. Prof Lihong V. Wang tem um interesse financeiro em Inc., Microphotoacoustics, Inc. e Endra, que, no entanto, não apoiar este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Home-made acoustic-optical beam combiner: | |||
| right-angle prism | Edmund Scientific | NT32-545 | |
| rhomboid prism | Edmund Scientific | NT49-419 | |
| silicone oil | Clearco Products | 1000cSt | |
| OR-PAM system | Microphotoacoustics | ||
References
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