Summary
פרוטוקול זה מספק הוראות לבחירת המשובטים תאים קו פליטת אור סידן assay כדי לנתח את מבנה פעילות יחסי נוירופפטידים arthropod מסונתז על GPCRs מאותו מקור שלהם. Assay זה יכול לשמש עבור deorphanization קולטן מבנה פעילות מחקרים היחסים לעיצוב אנלוגי פפטיד סינתטי / סמים להוביל לגילוי.
Abstract
קולטנים arthropod הורמון הם יעדים פוטנציאליים הדברה הרומן כפי שהם מווסתים תהליכים פיזיולוגיים רבים והתנהגותיים חיוני. רובם שייכים superfamily של G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs). התמקדנו באפיון קולטנים kinin arthropod מן סמן את יתושים. Kinins arthropod הם נוירופפטידים רב תכליתיים עם myotropic, משתן, תפקוד עצבי. הנה שיטה מנתח שיטתי של מבנה הפעילות של מערכות יחסים kinins חרקים על שני Heterologous kinin קולטן להביע מערכות מתואר. אנו מספקים מידע חשוב רלוונטיים לפיתוח של אנלוגים kinin biostable עם פוטנציאל לשבש את משתן, myotropic, ו / או תהליכי העיכול קרציות ויתושים.
הקולטנים kinin מן סמן את הבקר בדרום, Boophilus microplus (קאנסטריני), ואת Aedes יתוש aegypti (לינאוס), באו לידי ביטוי ביציבות בקו תא יונקים CHO-K1. מנתח פונקציונלית של קולטנים אלה הושלמו באמצעות פליטת אור סידן צלחת assay אשר מודד פליטת אור תאיים כדי לקבוע רמות הסידן cytoplasmic על פי בקשה פפטיד תאים אלה רקומביננטי. שיטה זו מנצלת את החלבון aequorin, photoprotein מבודד זורח מדוזה. אנו transiently transfected aequorin פלסמיד (mtAEQ/pcDNA1) בקווים תא ביציבות הביע את הקולטנים kinin. תאים אלה טופלו אז עם coelenterazine cofactor, אשר קומפלקסים עם aequorin תאיים. קשר זה שובר בנוכחות סידן, פולטות רמות הארה מעיד על ריכוז סידן. כאשר הקולטן kinin אותות באמצעות שחרור סידן תוך תאי, עוצמת האות קשורה עוצמה של הפפטיד.
פרוטוקול זה הוא סינתזה של פרוטוקולים שתואר קודם לכן עם מספר שינויים: הוא מציג צעד אחר צעד הוראות לביטוי יציב של GPCRs בקו תא יונקים באמצעות מבחני צלחת תפקודית (Staubly et al, 2002 ו אורוות et al, 1997.. ). שימוש במתודולוגיה זו, הצלחנו להקים שורות תאים יציבות המבטאת את היתושים ואת kinin קולטנים סמן, להשוות את העוצמה של שלושה kinins יתושים, לזהות קריטי עמדות החומצה האמינית לאינטראקציה ליגנד לקולטן, ולבצע למחצה ההקרנה של פפטיד הספרייה. מכיוון kinins חרקים רגישים השפלה אנזימטית מהירה על ידי peptidases אנדוגני, הם מוגבלים קשות ככלים הדברה או מחקרים endocrinological בשימוש. לכן בדקנו גם אנלוגים kinin isobutyric המכילים חומצה אמינית (AIB) כדי לשפר את העוצמה שלהם biostability. זה אנלוגי peptidase עמידים מייצג להוביל חשוב בהתפתחות של biostable אנלוגים kinin חרקים עשויה לסייע בפיתוח של neuropeptide מבוססי אסטרטגיות שליטה arthropod.
Protocol
1. הקמתה של שורות תאים יציבות
- Clone GPCR העניין שלך ולהכניס אותו לתוך וקטור ביטוי שילוב קוזאק '5 רצף קונצנזוס (GCCA / GCCATGG) סביב קודון ההתחלה עבור מחייב ריבוזומלי אופטימלית במערכת יונקים (קוזאק, 1986). כאן אנו משתמשים pcDNA3.1/Bm-KR פלסמיד עבור קולטן סמן kinin, ואת pcDNA3.1/Aedae-KR פלסמיד עבור קולטן kinin יתוש (הולמס et al, 2003;. Pietrantonio et al, 2005).. PcDNA3.1 (-) וקטור מקודד התנגדות אמפיצילין עבור הבחירה חיידקים neomycin (G418) התנגדות לבחירה בתאי יונקים.
- לגדול CHO-K1 תאים ריקים (ללא פלסמידים) (ATCC, Manassas, VA, ארה"ב) או תאים אחרים קו הרצויה בבקבוק T-25 (BD פלקון) בשעה 37 ° C ב 5% CO 2 באינקובטור humidified (הולמס ואח' ., 2003). Incubations כל עוד צריך להיעשות בתנאים אלה אלא אם צוין אחרת. שמירה על תאים ריקים במדיום הגידול (המדיום F12K עם סרום 10% שור עוברי) עם 1X לאנטיביוטיקה Antimycotic (Invitrogen, CA).
- כדי לפצל תאים, לחמם את כל פתרונות 37 ° C. הסר בינוני הישן בבקבוק T-25 ולשטוף עם 5 מ"ל PBS ולאחר מכן להסיר PBS. כדי trypsinize התאים, להוסיף 2 מ"ל PBS-טריפסין-EDTA (34 מ"ל PBS, 2 מ"ל סודיום ביקרבונט 7.5%, 4 מ"ל 10X טריפסין-EDTA) במשך 2 דקות. הוסף 3 בינוני מ"ל לשאוב בינוני למעלה ולמטה כדי לערבב תאים. העברת בינוני עם תאים לתוך צינור חרוטי ו צנטריפוגות דקות 2 ב ~ 200-300 גרם (1,000 סל"ד). בטל supernatant מחדש להשעות תאים בינוניים 5 מ"ל. לדלל את התאים resuspended ריכוז של 1:05 או 1:10 עם מדיום חדש ולהעביר 5 מ"ל בבקבוק T-25 חדש.
- אחרי התאים גדלים בריא (כ 2-3 ימים), הזרע CHO-K1 תאים לתוך T-25 צלוחיות תרבות רקמות לגדל אותם ללון בינוני צמיחה ללא אנטיביוטיקה עד שהם ומחוברות כ -30% (כ 18 שעות). מידת confluency ניתן לקבוע על ידי התבוננות בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה.
- הכן את התערובות הבאות עבור כל דגימה:
- שלב 1-2 DNA מיקרוגרם (לדוגמה: 4μl השימוש 265μg/μl pcDNA3.1/Aedae-KR) עם 100 μl Opti-ממ אני מופחת סרום בינוני (Invitrogen).
- מערבבים 6 מגיב Lipofectin μl (InvitrogenTM) לתוך מדיום 100 μl בסרום F12K חינם, קבלת יחס של 1:01 Lipofectin ל-DNA. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30-45 דקות.
- הסר את מדיום הגידול הישן מן התאים לשטוף את התאים עם 5 בינוני מ"ל סרום F12K חינם ולאחר מכן להסיר את המדיום בסרום F12K חינם. בתוך שפופרת 15 מ"ל, לערבב בעדינות את התערובת לתוך transfection 1.8 מ"ל של מדיום F12K טרי בצורה טיפה חכם. לאחר מכן, לשטוף את התאים מן הצעד 1.5 עם PBS ולהוסיף את הפתרון הזה transfection חדש על התאים. דגירה של 18 שעות.
- שנה את בינונית עד F12K בינוני פלוס 10% בסרום שור עוברית ללא אנטיביוטיקה דגירה לילה. פצל את התאים לשתי T-25 צלוחיות עם F12K בינוני פלוס 10% בסרום שור עוברית ללא אנטיביוטיקה לעוד 18 שעות (עבור תאים פיצול אנא ראה שלב 1.3).
- החלף את בינוני עם בינוני סלקטיבית (בינוני F12K בתוספת 10% בסרום שור עוברית עם 800μg/ml GENETICIN, Invitrogen). התרבות התאים באמצעות מדיום סלקטיבית עבור 3-4 שבועות. במשך הזמן הזה יבחר עבור תאים שילבו ביציבות הפלסמיד לתוך הדנ"א הגנומי שלהם. המשך שמירה על תאים באמצעות תחזוקה בינוני (מדיום F12K בתוספת 10% בסרום שור עוברית עם 400μg/ml GENETICIN). מעת לעת להקפיא שורות תאים עם יחס של 1:01 התקשורת הקפאה (בינוני סלקטיבית עם DMSO 20%) כדי למנוע מאבד במקרה של זיהום בלתי צפוי.
- בחירת שורות תאים משובט: כצעד ראשון, trypsinize ו צנטריפוגות התאים משלב 1.8 עם המדיום תחזוקה כמו בשלב 1.3. Re-להשעות תאים בינוניים 5 מ"ל תחזוקה, לקחת 0.5 מ"ל של התא להשעות ומוסיפים 4.5 מ"ל של מדיום תחזוקה טריים לבצע דילול 10x. מעבירים את דילול 10x לתוך צלחת של 12 בארות 96 היטב, מוסיפים 100 μl היטב כל כדי לבחור עבור תאים בודדים.
- המשך לבצע דילולים סדרתי 10x של תאים אלה על ההשעיה הסופית התיאורטית של תא אחד לכל μl 100 (בדרך כלל הדילול הסופי יהיה בטווח של 10 -11 עד 10 -19, המספר הכולל של דילולים סדרתי 10x הוא ~ 19) . מיד לאחר דילול כל, להעביר 100 μl של דילול לתוך צלחת של 12 בארות 96 הבאר. לאחר דגירה 18 שעות, 96 צלחות לצפות גם תחת אור הפוכה או פלואורסצנציה מיקרוסקופ ו סימן בארות שנראים להכיל רק תא אחד בודד או מכילים שני תאים מחולק ברור מתא אחד בודד. שמור התבוננות בכל יום בינוני לשנות כל שלושה ימים.
- כאשר בארות הם conflu 80%אף אוזן גרון (כשבוע), לשטוף בארות המסומנים PBS 200 μl ו trypsinize אותם עם 100 μl של פתרון PBS-טריפסין-EDTA. העברת התאים מכל מסומנים היטב לתוך אחד טוב של צלחת 6-היטב עם 1 בינוני תחזוקה מ"ל. לגדל תאים אלה במשך 3 ימים ולאחר מכן להעביר לתוך בקבוק T25 תאים בודדים. בדיקת התאים האלה באמצעות פליטת אור סידן assay פפטידים עם אגוניסט (ראה סעיף 2).
- בחר קו 1 לתא משלב 1.11 עם התגובה הגבוה ביותר assay פליטת אור סידן הצלחת לבצע בפעם השניה הבחירה תא אחד הצעדים הבאים 1.9-1.11. מעת לעת להקפיא שורות תאים.
- מתוך מבחר המשני המתואר בשלב 1.12, לבחור 2-3 שורות תאים עם התגובה הגבוה ביותר assay פליטת אור סידן צלחת ולשמור אותם בתרבות להמשך מבחני פליטת אור סידן צלחת. עקוב אחר מספרי המעבר. מעת לעת, להקפיא שורות תאים מ קטעים מוקדם, כך שאתה תמיד יכול לחזור אליהם אם שורות תאים עם קטעים יותר להפסיק ביצוע עקבי.
2. פליטת אור סידן צלחת assay
- ולקשור את הגן הכתב עניין לתוך וקטור ביטוי. כאן השתמשנו mtAEQ/pcDNA1 aequorin פלסמיד (מתנה בני הזוג. CJP Grimmelikhuijzen ומיכאל וויליאמסון, באוניברסיטת קופנהגן, דנמרק). להפוך את הפלסמיד ב E. תאים coli MC1061/PS (Invitrogen) ולטהר אותם באמצעות ספין QIAprep miniprep Kit (Qiagen Inc). בשלב האחרון elute הפלסמיד עם טריס חיץ ללא EDTA, לא מים.
- לגדול שורות תאים מ - 1.13 צעד המבטא את הקולטן הרצוי בינוני תחזוקה. כאשר התאים הם 90% ומחוברות, trypsinize, צנטריפוגה ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים בינוני 5 מ"ל תחזוקה כמו בשלב 1.3. מדולל תאים (10x על בינוני עם אחזקה) לספור מספר התא עם תא לדלפק (Bright-Line Hemacytometer) תחת מיקרוסקופ. התאם את מספר התא לכ 2 x 10 5 תאים / מ"ל (ממוצע 20 התאים אחד 9 ריבועים הראו ב Hemacytometer). 2 תאים Seed מ"ל מדולל בתקשורת לבאר כל צלחת שישה היטב. דגירה למשך 24 שעות (התאים אמורים להגיע כ -60% confluency לאחר דגירה).
- שינוי התקשורת בצלחת בארות 6 עד בינוני OPTI-ממ. עבור כל טוב, לערבב 96 μl OPTI-ממ עם 4 מגיב transfection μl 6 FuGENE (ביוכימיקלים רוש) בצינור microfuge ולהניח בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. הוסף 1 מיקרוגרם של ה-DNA 1 aequorin / pcDNA הפלסמיד לתוך צינור אחד, ואז ללחוץ בעדינות את המדגם עבור דק '1, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15-20 דקות. הוסף את כל התערובת היטב כל באופן dropwise בעוד בעדינות מטלטל את הצלחת היטב. דגירה הצלחות במשך 6 שעות ולשנות את F12K בינוני עד בינוני מכיל 10% בסרום שור עוברית ללא אנטיביוטיקה.
- לאחר דוגרים התאים בצלחת כמו שש ל -24 שעות, trypsinize, צנטריפוגה מחדש להשעות את התאים כצעד 1.3. ספירת התאים 400,000 תאים / מ"ל כצעד 2.1 והעברת 100 μl (μl סך 40,000 cells/100) לתוך הבאר כל אחד 96-היטב צלחת לבנה רזה התחתונה microtitre (שחקן המשנה 3610). דגירה עוד 24 שעות עד confluency על 80% התא. זהו ריכוז אופטימלי של תאים assay פליטת אור.
- הכן 90μl/well של סידן ללא DMEM מדיה (Invitrogen) המכיל 5 coelenterazine מיקרומטר (Invitrogen) בחושך (coelenterazine הוא רגיש לאור). קחו את הצלחת 2.4, להסיר התקשורת הישנה להוסיף 90μl לבאר כל אחד. דגירה צלחות במשך 3 שעות בחושך ב 37 ° C ו 5% CO 2, לאחר מכן את התאים בצלחת מוכנים להיבדק.
3. כלי ניתוח וניתוח נתונים
- כל הקורא צלחת פליטת אור שונה. אנו מבצעים assay שלנו באמצעות קורא (Labtechnologies BMG) NOVOstar צלחת במצב bioluminensence. אם אתם משתמשים בכלי אחר, אתה חייב להתאים את פרוטוקול.
- טהר את הקורא צלחת משאבות (משאבות או PRIME) לפני השימוש. כבה את האור בחדר לפני לשים את הצלחת על בעל צלחת. לאחר מחזיק צלחת נסגר, להדליק את האור.
- Solubilize פפטידים (ב 1.5 מ"ל Eppendorf שפופרת) של סידן ללא מדיה DMEM. בחר את "עומק לשאוב" ו "קביעת עמדה" הפתרון פפטיד לפני השימוש. לאתגר את התאים μl 10 (10x) של ריכוזים שונים של פפטידים (FFFSWG-NH2, Aedes-K1-3, או הפפטיד הרצוי אחרים) ומיד להתחיל בהקלטת פליטת האור. אנחנו צריכים להגדיר את המכשיר כדי להקליט את פליטת האור (465 ננומטר) עבור כל טוב כל 2 שניות למשך זמן כולל של 50 שניות.
- הקפד לכלול שליטה חיובית כגון אנלוגי פעיל (אנלוגי FFFSWGa נעשה שימוש, Taneja-Bageshwar et al. 2009) ו שליטה שליליות כגון תאים וקטור transfected בלבד. השליטה שלילי יהיה צורך במהלך ניתוח הנתונים כדי לקבוע את הסף הבסיסי (ראה תוצאות נציג).הפפטיד קשור, פעיל ניתן גם להוסיף כביקורת שלילית.
- לאחר ריצה תושלם, לשטוף את המשאבה מכשיר (או משאבות PRIME) אז במקום מדגם הפפטיד הבא שלך. שמירת הנתונים לשטוף את משאבות שוב.
- טיפול נתונים: העברת נתונים של פליטת האור מבאר כל לתוך גיליון Excel נתונים של מיקרוסופט.
- הדבקת נתונים מ-Excel ל פריזמה תוכנה 4.0 מ GraphPad Software Inc (סן דייגו, קליפורניה, ארה"ב). ריכוזי הפפטיד השונים הוא ציר ה-X יחידות פליטת אור הוא ציר Y. כדי לנרמל את הנתונים, העלילה עקומת יומן התגובה. בחר רגרסיה ליניארית עקומת בכושר ניתוח (המשוואה sigmoidal מנה תגובה עם שיפוע משתנה) כדי להשיג ריכוז בתגובה עיקולים על פפטיד זה. המגרשים בתוכנית ערכים בסופו של דבר והוא נותן את EC 50.
- כל ניסוי יש לחזור שלוש פעמים לניתוח נתונים.
4. נציג תוצאות:
כאשר ביטוי CHO-K1 תאים, Aedes יתוש קולטן aegypti kinin התנהג כמו הקולטן multiligand והן מבחינה תפקודית הגיב ריכוזים נמוך כמו 1 ננומטר של שלושת endogenours Aedes kinins, Aedae kinins 1-3, נבדק בנפרד באמצעות פליטת אור סידן assay צלחת . איור 1 מראה כי צו בדרגת עוצמה שהושג היה Aedae-K-3> Aedae-K-2> Aedae-K-1, המבוסס על בהתאמה EC 50 ערכי Aedae-K-3, 16.04 nM; Aedae-K- 2, 26.6 ננומטר Aedae-K-1, 48.85 ננומטר, אשר היו שונים באופן משמעותי מבחינה סטטיסטית (p <0.05) (Pietrantonio et al. 2005).
יש לנו גם השתמשו assay כדי לקבוע אילו שאריות kinin הם קריטיים עבור אינטראקציה הפפטיד קולטן kinin. חרקים פפטידים kinin לשתף pentapeptide בטרמינל C-המייצג את רצף מינימלי הנדרש עבור פעילות ביולוגית, המכונה גם ליבה. בלוח 1, הליבה אנלוגים kinin פפטיד היו מסונתז כסדרת תחליף אלאנין של kinin הליבה pentapeptide FFSWGa ונבדקו על ידי פליטת אור assay צלחת סידן (Taneja-Bageshwar et al. 2006). מצאנו כי חומצות אמינו Phe 1 ו TRP 4 היו חיוניים לפעילות של kinins חרקים הן עבור הקולטנים.
Assay גם יכול לשמש כדי לבדוק פפטידים המיועדים biostability משופרת. טבלה 2 מראה את אנלוגים kinin מעוצב המכיל חומצה אמינו isobutyric (AIB) נבדק על קולטן סמן רקומביננטי kinin ו תרשים 2 מציג את ההשוואה הפעילות של שישה אלפא חומצה אמינית אנלוגים isobutyric על קולטן סמן kinin להביע CHO-K1 קו תאים על ידי סידן צלחת פליטת אור assay (Taneja-Bageshwar et al. 2009). Hexapeptide אנלוגי FFFSWGa נוסף עבור פקד חיובית עבור פעילות הקולטן. אנלוגי FF [AIB] WGA הביא פעיל יותר אנלוגי שליטה זו hexapeptide. אנלוגי עם שני מחליפים חומצה aminoisobutyric, [AIB] FF [AIB] WGA, היה החזק ביותר של החלפת פעמיים אנלוגים נבדק (לוח 2 ואיור 2).
לדוגמאות נוספות של assay כמה זה כבר יכול להיות מיושם לראות נחמן Pietantonio (2010), נחמן et al. (2009), Taneja-Bageshwar et al. (2008a), ו-Taneja Bageshwar et al. (2008b).
באיור 1. הערכת Aedes kinins ריכוז יעיל (EC 50) על CHO-K1 בתאים E10 ידי assay סידן פליטת אור צלחת. ציר y ב ריכוז בתגובה עקומות התקבל יחידות פליטת אור מבוטא כאחוז התגובה המקסימלי שנצפה עבור כל הפפטיד. נקודות הנתונים מייצגים את הממוצע של שישה משכפל שהושגו במהלך שלושה ניסויים עצמאיים. ברים מייצגים את שגיאת התקן. (א) שערוך Aedae-K1 EC 50 = 48 ננומטר. (ב) הערכת Aedae-K2 EC 50 = 26 ננומטר. (ג) הערכת Aedae-K3 EC 50 = 16 ננומטר. EC-50 Aedae K3 <EC 50 Aedae-K2 <EC 50 Aedae-K1, p <0.05. ניתוח סטטיסטי וגרפים היו עם תוכנת Prism 4.0 GraphPad.
איור 2. השוואה פעילות של שישה אלפא חומצה אמינית אנלוגים isobutyric על קולטן סמן kinin להביע CHO-K1 קו תאים על ידי פליטת אור assay סידן צלחת. ציר y מייצג אחוז מקסימלי יחידות פליטת אור אנלוגי עבור כל מבוטא כאחוז של פליטת אור שנצפה בריכוז לעומת התגובה המקסימלי שנצפה בין כל ריכוזי נבדק אנלוגי אחד. ניתוח סטטיסטי וגרפים בוצעו באמצעות תוכנת Prism GraphPad 4.0.
| סמן את התא בשורה קולטן | קולטן תא יתוש קו | פפטידים | EC 50 (ננומטר) | פליטת אור תגובה מקסימלי על 1 מ"מ | EC 50 (ננומטר) | פליטת אור תגובה מקסימלי על 1 מ"מ | |||
| AFSWGa | אני | אני | אני | אני | |||||
| FASWGa | 586 | 5600 | ND | 400 | |||||
| FFAWGa | 64 | 12,800 | 621 | 3050 | |||||
| FFSAGa | אני | אני | אני | אני | |||||
| FFSWAa | 417 | 10,600 | 2800 | 1830 | |||||
| FFSWGa | 590 | 10,800 | ND | 525 | |||||
| FSWGa | אני | אני | אני | אני | |||||
| FFSWa | אני | אני | אני | אני | |||||
| FFSWG-OH | אני | אני | אני | אני | |||||
| FFFSWGa | 259 | 13,000 | 562 | 10,000 | |||||
| FF [AIB] WGA | 29 | 12,700 | 445 | 9300 | |||||
החוזקים משוער טבלה 1. (EC 50) ותגובה פליטת אור מקסימלי של כל נבדק על פפטידים סמן ואת הקולטן יתוש קווי transfected תא *.
* EC 50 מעריכה את הריכוז הנדרש כדי לעורר תגובה חצי מקסימלי. אני: לא פעילה אם התגובה פליטת אור הוא פחות מ 300 יחידות (רמת וקטור רק תאים transfected). : המיקום שבו שאריות בהתאמה ב FFSWGa פפטיד הוחלף אלאנין. ND: אנלוגי נבדק אבל היה או לא היה מאוד פעיל או לא פעיל molarities נמוך יותר, ובכך EC50 לא ניתן לקבוע.
| K-AIB-1 | [AIB] FF [AIB] WGA |
| K-AIB-2 | [Α MEF] FF [AIB] WGA |
| K-AIB-3 | AC-R [AIB] FF [AIB] WGA |
| K-AIB-4 | AC-R [β3F] FF [AIB] WGA |
| K-AIB-5 | [AIB] RFF [AIB] WGA |
| K-AIB-6 | [AIB-AIB-AIB-AIB] RFF [AIB] WGA |
טבלה 2. Kinin אנלוגים (K) המכילים חומצה אמינית isobutyric (AIB) נבדק על קולטן סמן רקומביננטי kinin. Ac: אצטיל; α אני: α-methyl פנילאלנין; β3F: β3-פנילאלנין;: אמיד.
Discussion
הצלחנו לבצע את אפיון פונקציונלי של הקולטן neuropeptide הראשון שהתגלה מן Arachnida (קרציות, קרדיות, עכבישים), הקולטן kinin סמן, תוך שימוש בפרוטוקול זה. שיטה זו כוללת שלושה יישומים ראשוניים. ראשית, הטכניקה ניתן ליישם על deorphanization הקולטן באמצעות מדידות פעילות ליגנד. שנית, assay יכול לפתור ליגנד לקולטן מבנה פעילות יחסים (SAR). שלישית, השיטות ניתן להשתמש גילוי תרופות. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור את פעילותו של אגוניסטים או אנטגוניסטים על כמעט כל GPCR. אנחנו מתחילים להתאים את פרוטוקול להקרנה של ספריות קטנות. השורה תא השתמשנו אינו מבטא את החלבון נמצא בכל מקום G G 16. לא היינו צריכים את זה כי arthropod קולטנים kinin האות דרך החלבון GQ ואת מפל סידן תוך תאי והם לשמר את המאפיינים איתות בתאי יונקים כפי שמוצג כאן.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
בני הזוג. CJP Grimmelikhuijzen ומיכאל וויליאמסון מאוניברסיטת קופנהאגן (דנמרק) זוכים להערכה למתן aequorin הפלסמיד. משתף פעולה שלנו, ד"ר רונלד J. נחמן ARS-USDA (טקסס, ארה"ב), הוא הודה לסינתזה פפטיד ו למתן את הקורא צלחת NOVOstar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| CHO-K1 cells | ATCC | CCL-61 | Manassas, VA, USA |
| F12K medium | Invitrogen | 21127 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectin Reagent | Invitrogen | 18292-011 | |
| GENETICIN | Invitrogen | 10131035 | |
| MC1061/P3 Ultracomp | Invitrogen | C663-03 | |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 19064 | |
| FuGENE 6 Transfection reagent | Roche Group | 11 814 443 001 | |
| 96-well white thin bottom microtitere plate | Costar | 3610 | |
| calcium-free DMEM media | Invitrogen | 21068 | |
| C–lenterazine | Invitrogen | C-2944 | |
| Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | Horsham, PA | |
| NOVOstar | BMG Labtechnologies | ||
| Prism software 4.0 | GraphPad Software Inc. | San Diego, CA, USA | |
| T-25 and T-75 Flasks | BD Biosciences | 353014 and 353135 |
References
- Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).
- Nachman, R., Pietrantonio, P. V. Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors. Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control. Geary, T. , Landes Bioscience. Madamme Curie Library. (2010).
- Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs. Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).
- Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs. General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).
- Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus. Peptides. 29, 295-301 Forthcoming.
- Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti. Peptides. 29, 302-309 Forthcoming.
- Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).
- Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins. Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).
- Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor. Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).
- Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).
- Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor. Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).
