Summary
Быстрый, простой и экономически эффективный протокол для поколения доноров полученных multivirus конкретных ЦТЛ (rCTL) для инфузий в аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) получателей риск развития ЦМВ, Adv или EBV инфекции. Этот производственный процесс GMP-совместимый и должны обеспечить более широкую реализацию Т-клеточной иммунотерапии за пределы специализированных центрах.
Abstract
Вирусные инфекции вызывают заболеваемость и смертность в аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) получателей. Мы и другие успешно создан и придают T-клетки, специфические для Эпштейна Барр (ВЭБ), цитомегаловирус (ЦМВ) и аденовирус (Adv) с помощью моноцитов и EBV-преобразовано лимфобластоидных клетки (EBV-LCL) генно-модифицированных с аденовирусом вектор антиген представляющих клеток (БТР). Каких-то 2х10 5 / кг trivirus-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) распространились на несколько журналов после инфузии и, казалось, для профилактики и лечения даже тяжелых вирусных заболеваний, устойчивых к другим доступных методов лечения. Более полно выполнить этот обнадеживающий подход ограничен высокими издержками производства, сложности изготовления и длительного времени (4-6 недели EBV-LCL поколения, и 4-8 недель для CTL производства - всего 10-14 недели) для подготовки. Для преодоления этих ограничений мы разработали новые, GMP-совместимый протокол CTL производства. Во-первых, вместо adenovectors стимулировать Т-клеток, мы используем дендритные клетки (ДК) nucleofected с ДНК плазмиды кодирования LMP2, EBNA1 и BZLF1 (ВЭБ), Hexon и Пентон (Adv), и РР65 и IE1 (ЦМВ) в качестве антиген-представляющих клеток. Эти бронетранспортеры активировать Т-клетки, специфичные для всех стимулирующих антигенов. Во-вторых, культура активированных Т-клеток в присутствии ИЛ-4 (1,000 ед / мл) и IL-7 (10ng/ml) увеличивает и поддерживает репертуар и частота специфических Т клеток в наших линиях. В-третьих, мы использовали новые, газопроницаемых устройство культуры (G-REX), что способствует расширению и выживания большого количества клеток после однократного стимуляция, тем самым устраняя потребность в ВЭБ-LCLS и сокращения техник вмешательства. За счет внедрения этих изменений мы можем теперь производить multispecific CTL ориентации EBV, CMV, и Adv по цене на 10 6 клеток, уменьшается на> 90%, а всего за 10 дней, а не 10 недель, используя подход, который может быть распространен на дополнительные защитные вирусных антигенов. Наши FDA утвержденных подход должен иметь значение для профилактики и лечения заявок на высокий риск аллогенных ГСК получателей.
Protocol
1. DC nucleofection
- Урожай моноцитарных контроллеры домена, которые были обогащены с использованием пластиковых приверженности, культивировали в течение 5 дней с помощью сотового Genix среде с IL4 (1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) и далее созрел в течение 24 часов использования созревания DC цитокинов IL4 (1000U / мл), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml и PGE2 (1μg/ml) 1, нежным ресуспендирования с 3 мл пипетки передачи.
- Граф жизнеспособной контроллеры домена с использованием трипанового синий, передачи в 3-кратным 15 мл пробирки с не менее чем 0.5x10 6 и не более 2х10 6 кл / трубы.
- Центрифуга для РС 10mins @ 200г. За это время предварительно теплой сотовый Genix среде с созреванием DC цитокинов (СМИ DC созревания) - 2ml/well в трех скважинах 12-а тканевая культура рассматривается пластины в 37 ° С / 5% СО 2 инкубатора.
- Как только клетки закончили спиннинг, аспирация супернатант и добавить соответствующие плазмиды ДНК, чтобы каждый из трубы в конечной концентрации 5 мкг ДНК / трубы. В этом случае добавить плазмиды, кодирующей IE1-РР65 к трубе № 1, Hexon-Пентон к трубе № 2, и EBNA1-LMP2-BZLF1 к трубе № 3.
- Ресуспендируют ДК и ДНК с 100 мкл раствора nucloefection Amaxa, хорошо перемешать и трансфер в nucleofection кювет.
- Место в кювет 4D nucleofector, выберите программу CB150 (Amaxa / Lonza), и нажать старт.
- Сразу же после nucleofection добавить 500 мкл в 2 мл подогретого сотовый Genix DC созревания СМИ кюветы, аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз по 2-3 раза, и передача nucleofected РС подготовлена 12-луночного планшета содержащих оставшиеся 1,5 мл предварительно нагретого СМИ DC созревания. Трансфер в 37 ° С / 5% СО 2 инкубатора для дальнейшей 12-18hrs.
2. Т-клеток, стимуляция
- Урожай и считать nucleofected контроллеры домена, и облучать на 30Gy. Вымойте раз с 10 мл среды CTL (45% RPMI, 45% кликов EHAA, 10% ЭТС, 2мм Glutamax) и ресуспендируйте @ 3 х 10 5 контроллеров домена на мл CTL СМИ.
- Бассейн минимум 7.5x10 5 (2,5 мл) и максимум 15x10 5 (5 мл) ДК содержащие каждый из плазмид и передача объединенных РС G-Rex устройства, которые затем будут помещены в инкубатор.
- Для подготовки клетки ответчик использовать либо ранее замороженных МНПК или не соблюдают мононуклеарных клеток, которые остаются после выбора постоянного тока (следование или CD14 выбор). Оттепель клетки, трансфер в нагретого культуральной среде, мыть один раз с CTL СМИ. Ресуспендируют клеток в СМИ CTL, граф клеток и довести их до концентрации 2х10 6 клеток на мл. Возьмите 15x10 6 ячеек или 7.5ml и дополнения 30000U IL4 (1000U/ml -. Окончательным концом) и 300ng IL7 (10ng/ml - финальный конц.).
- Передача 7.5ml из РВМС (15x10 6 ячеек) для G-Rex и пополнить биореактор с CTL СМИ, чтобы общий объем 30 мл.
- Культура G-Rex в течение 6-7 дней при 37 ° С / 5% CO 2 увлажненный инкубатора.
3. Т-клеток расширения
- В день 6-7, 10 мл аспирата средств массовой информации, затем смешать клетки в оставшихся 20 мл среды с 10 мл пипетки и считать жизнеспособных клеток с трипановым синий. Если Есть <50x10 6 пополнится свежим медиа + цитокинов. Если Есть> 50x10 6 ячеек удалить 10 мл клеточной суспензии, переезд в новый G-Rex, а затем кормить как G-Rexs со свежими CTL СМИ + цитокинов.
- Культура для дополнительных 4-6 дней. После достаточного клетки были расширены, выполните фенотипические и функциональные характеристики CTL и cryopreserve избыток для будущего использования.
4. Представитель Результаты:
Схема нашей FDA утвержденных multivirus конкретных CTL процесса генерации показано на рисунке 1. В отличие от конвенции multivirus CTL протоколы, которые используют adenovectors и EBV-LCL, чтобы стимулировать вирус-реактивных Т-клеток, 2 мы пришли на смену инфекционным материалом вируса с ДНК плазмиды , которые кодируют несколько антигенов производным от каждого из вирусов 3. Чтобы стимулировать trivirus CTL, нами разработаны три multicistronic плазмид кодирования Hexon и Пентон аденовируса, IE1 и РР65 ЦМВ, и EBNA1, LMP2, а BZLF1 ВЭБ. Эти антигены были выбраны на основе поощрения клинические результаты наших собственных и других групп, показывающие, что Т-клетки, направленный против Adv-hexon и Пентон 2,4-6, а также ЦМВ-1E1 и ЦМВ РР65 являются защитными в естественных условиях 7. Для EBV, EBNA1 является иммунодоминантные CD4 + T-клетки-мишени антиген экспрессируется во всех EBV-связанных злокачественных опухолей и в нормальных ВЭБ-инфицированных клеток 8,9, LMP2 является иммуногенной на несколько типов HLA и выражается в самых EBV злокачественных новообразований, в то время как 10,11 BZLF1 кодирует иммунодоминантные, немедленное рано литического цикла антиген, который стимулирует CD4 + и CD8 + Т-клеток от большинства людей и, вероятно, важна для сотрудничестваntrol клеток репликация вируса 12. Для дальнейшей оптимизации наших методов производства мы сотрудничали с природой технологий, создавшим minimalized, антибиотиков (FDA-совместимый) плазмиды для стимуляции ЦТЛ 13,14. С помощью этой стратегии мы последовательно достичь nucleofection КПД> 35% при сохранении высокой жизнеспособности клеток (данные не представлены) 3. Рисунок 2 показывает, что частота вирус-специфических Т-клеток в ответ на оптимизированных плазмиды ДНК, как измеряется IFNγ ELISpot, было больше, , чем в ответ на обычные pShuttle основе плазмиды экспрессии выражения же антигены (п = 8 аденовирус, п = 4 ЦМВ, и п = 2 EBV). Оптимальное соотношение DC: РВМС было важно для мощных стимуляция Т-клеток, как показано на рисунке 3, где отношение 1:50 производятся неоптимальной активации по сравнению с 1:20 S: R отношение (п = 2 доноров). Производство достаточного CTL номера с широкими специфичность антигена предпосылкой для клинической эффективностью против всех трех вирусов. Это достигается за счет CTL культуры в G-Rex, которая поддерживает превосходные Т расширение ячейки по сравнению с обычными 24-луночных планшетах (рис. 4а) 15, в то время как добавление IL4 и IL7 к культурам увеличивает репертуар и специфичность как показано на рисунке 4В где частота Т-клеток, реактивная против ЦМВ РР65 полученных HLA-A2 resticted NLV пептид был оценен в культурах, генерируемых в присутствии или отсутствии IL4 и / или IL7 16,17. Для оценки фенотипа и функциональных возможностей расширен клетки мы проводим проточной цитометрии анализа внутриклеточных цитокинов окрашивания / IFNγ ELISpot и Cr 51 анализов релиз на конечный продукт для криоконсервации / в инфузии. Обычно сгенерированный клетки поликлональных со смешанным населением CD4 + и CD8 + Т-клеток с антигеном-специфичность обнаруживается в обоих отсеках Т клетки. CTL способны убить вирусный антиген-клеток, экспрессирующих цели, но не вирус отрицательный частично HLA соответствие цели, указывая, что они не должны вызывать трансплантат против хозяина (GVHD) в естественных условиях (рис. 5).
Рисунок 1. RCTL поколение протокола. Во-первых, контроллеры домена являются nucleofected с вирусного антигена кодирования плазмиды и затем смешивается с аутологичной МНПК на R: S 10 или 20:1. Клетки разлагаются в G-Rex в течение 10-14 дней в присутствии IL4 и IL7, затем собирают, считая, проверены на функции, идентичность и стерильность, а затем криоконсервированных для клинического использования.
Рисунок 2. Оптимизированная плазмид ДНК вызывают превосходной активацию Т-клеток в пробирке. Контроллеры домена были nucleofected с оптимизированной, FDA-совместимые плазмиды кодирования Hexon и Пентон (Adv), IE1 и РР65 (ЦМВ), и EBNA1, LMP2, а BZLF1 (ВЭБ) или обычные плазмиды pShuttle кодирования же антигены. Они были использованы, чтобы стимулировать Т-клетки и специфичность была проанализирована IFNγ ELISpot 10 дней после стимуляции.
Рисунок 3 Оптимальное DC:. Соотношение T ячейки для CTL активации. Контроллеры домена от 2 доноров nucleofected со всеми тремя оптимизированы плазмид, а затем используются для стимуляции аутологичных МНПК в 1:20 или 1:50 DC: РВМС отношение. Частота реактивации Т-клеток была оценена на 10 день от IFNγ ELISpot.
Рисунок 4. Т-клеток расширение G-Rex использованием повышения цитокинов. Группа показывает, G-Rex устройства, а также появление на CTL мембраны газопроницаемых, оценивали с помощью микроскопа. Сравнение между сотовыми выход, достигнутых в культуре ткани конвенции рассматриваются пластины против G-Rex также показано на рисунке. Группа B показывает частоту ЦМВ пентамера положительные CTL, достигнутые в культурах расширен в наличии не цитокинов, IL4 один, IL7 один и IL4 + IL7.
Рисунок 5. Фенотип и функции расширенного CTL. Группа показывает типичный пример фенотип расширен CTL multivirus, которые поликлональных смесью CD4 + (45% - помощник) и CD8 + (42% - цитотоксические) Т-клетки, из которых большинство (95%) выразили памяти маркер CD45RO + / CD62L +. Группа B показывает, что эти клетки являются специфическими для всех стимулирующих антигенов и полифункциональных по оценке внутриклеточного окрашивания цитокинов обнаружить производства IFNΓ и ФНО после антигена стимуляции. группы С показывает, что расширил CTL, являются действительными измеряется по 51 Cr анализа. Аутологичная LCL, либо самостоятельно, либо трансдуцированных с нулевого вектора или аденовирусного вектора выражения ЦМВ РР65 были использованы в качестве смолыполучает. Alloreactivity оценивалась с использованием аллогенных PHA взрывы в качестве мишени.
Discussion
Вирусные инфекции составляют существенную заболеваемости и смертности у пациентов, которые иммунитетом от своей болезни и ее лечении. После ГСК, например, инфекции, вызванные вирусом герпеса стойкие, такие как ВЭБ и ЦМВ, а также респираторные вирусы, такие как респираторно-синцитиальный вирус (RSV), хорошо известны, в то время как важность инфекций, вызванных Adv, BK вируса и человека вирус герпеса (HHV) -6 совсем недавно были оценены. Хотя фармакологические препараты являются стандартной терапией для некоторых инфекций, они имеют существенные токсичности, порождают устойчивые варианты, и часто неэффективны. Напротив, вирус-специфических Т клеток, полученных от доноров стволовых клеток оказались безопасными и эффективными для профилактики и лечения вирусной инфекции или болезни в гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) установление 2,5,6,18-21. Тем не менее, более широкое внедрение иммунотерапии Т-клеток, в конечном счете ограничено стоимость, сложность и время, необходимое для CTL производства.
Наш новый и быстрый подход для создания multivirus CTL, описанные в текущих рукописи, должны существенно усилить возможности цитотоксических Т-клеточной терапии вирусных заболеваний, что позволяет стратегию, чтобы стать стандартом лечения ослабленным иммунитетом хозяина. Использование плазмиды nucleofected контроллеры домена, как БТР позволяет презентации антигена с обеих MHC класса I и II без конкуренции со стороны вирусных векторов или даже из нескольких вирусных антигенов выражены в одной клетке с разных популяциях постоянного тока используются для каждой плазмиды 3. Использование Ил-4 / 7 увеличивает T выживания и пролиферации клеток, что соответственно повышает частоту и репертуар реагирования антиген-специфические Т-клетки 16,17. Наконец, культура в G-Rex резко снижает T апоптоз клеток при культуры. Газообмен (O 2 и СО в 2 выхода) происходит через кремниевые мембраны газопроницаемых в основании колбы, предотвращения гипоксии, позволяя большую глубину среды выше клеток, обеспечивая больше питательных веществ и разбавления отходы. Эта платформа также может быть распространено на дополнительные вирусов, когда защитные антигены идентифицированы.
Disclosures
Хуан Ф. Вера консультант Производство Уилсон Вольф. Другие авторы не имеют соответствующего раскрытия информации.
Acknowledgments
Эта работа проводится при поддержке Производство помощи клеточной терапии (контракта NIH-NHLBI (HB-10-03) HHSN26820100000C) (CMR), специализированные центры для клеточной терапии грант NIH-NHLBI 1 U54 HL081007 (CMR), ASBMT Молодые премии следователя (UG и СП), лейкемии и лимфомы общества Специальные научный сотрудник в области клинической премии исследований (UG) и Эми Strelzer Manasevit ученый премии (ОМЛ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellGenix | CellGenix | 2005 | |
| IL4 | R&D Systems | 204-IL/CF | |
| IL7 | PeproTech Inc | 200-15 | |
| Hyclone RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30096.01 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical, Inc. | HP1022 | |
| Nucleofector | Amaxa | AAF-1001B & AAF-1001X | |
| Nucleofection Kit | Amaxa | V4XP-3012 | |
| Plasmids | NTC | n/a | |
| GM-CSF | R&D Systems | 215-GM/CF | |
| IL1 | R&D Systems | 201-LB-025 | |
| IL6 | R&D Systems | 206-IL-CF | |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| PGE2 | Sigma-Aldrich | P6532-1MG | |
| G-Rex | Wilson Wolf Manufacturing | AY11-00027 |
References
- Kaka, A. S., Foster, A. E., Weiss, H. L., Rooney, C. M., Leen, A. M. Using dendritic cell maturation and IL-12 producing capacity as markers of function: a cautionary tale. J Immunother. 31, 359-369 (2008).
- Leen, A. M., Myers, G. D., Sili, U., Huls, M. H., Weiss, H., Leung, K. S., Carrum, G., Krance, R. A., Chang, C. C., Molldrem, J. J. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat. Med. 12, 1160-1166 (2006).
- Gerdemann, U., Christin, A. S., Vera, J. F., Ramos, C. A., Fujita, Y., Liu, H., Dilloo, D., Heslop, H. E., Brenner, M. K., Rooney, C. M., Leen, A. M. Nucleofection of DCs to generate Multivirus-specific T cells for prevention or treatment of viral infections in the immunocompromised host. Mol. Ther. 17, 1616-1625 (2009).
- Leen, A. M., Christin, A., Khalil, M., Weiss, H., Gee, A. P., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. Identification of hexon-specific CD4 and CD8 T-cell epitopes for vaccine and immunotherapy. J Virol. 82, 546-554 (2008).
- Leen, A. M., Christin, A., Myers, G. D., Liu, H., Cruz, C. R., Hanley, P. J., Kennedy-Nasser, A. A., Leung, K. S., Gee, A. P., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. Cytotoxic T lymphocyte therapy with donor T cells prevents and treats adenovirus and Epstein-Barr virus infections after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation. Blood. 114, 4283-4292 (2009).
- Feuchtinger, T., Matthes-Martin, S., Richard, C., Lion, T., Fuhrer, M., Hamprecht, K., Handgretinger, R., Peters, C., Schuster, F. R., Beck, R., Schumm, M., Lotfi, R., Jahn, G., Lang, P. Safe adoptive transfer of virus-specific T-cell immunity for the treatment of systemic adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. Br J Haematol. 134, 64-76 (2006).
- Bunde, T., Kirchner, A., Hoffmeister, B., Habedank, D., Hetzer, R., Cherepnev, G., Proesch, S., Reinke, P., Volk, H. D., Lehmkuhl, H., Kern, F. Protection from cytomegalovirus after transplantation is correlated with immediate early 1-specific CD8 T cells. J. Exp. Med. 201, 1031-1036 (2005).
- Leen, A., Meij, P., Redchenko, I., Middeldorp, J., Bloemena, E., Rickinson, A., Blake, N. Differential immunogenicity of Epstein-Barr virus latent-cycle proteins for human CD4(+) T-helper 1 responses. J Virol. 75, 8649-8659 (2001).
- Bickham, K., Munz, C., Tsang, M. L., Larsson, M., Fonteneau, J. F., Bhardwaj, N., Steinman, R. EBNA1-specific CD4+ T cells in healthy carriers of Epstein-Barr virus are primarily Th1 in function. J. Clin. Invest. 107, 121-130 (2001).
- Straathof, K. C., Leen, A. M., Buza, E. L., Taylor, G., Huls, M. H., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. Characterization of latent membrane protein 2 specificity in CTL lines from patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma and lymphoma. J. Immunol. 175, 4137-4147 (2005).
- Hislop, A. D., Taylor, G. S., Sauce, D., Rickinson, A. B. Cellular responses to viral infection in humans: lessons from Epstein-Barr virus. Annu. Rev. Immunol. 25, 587-617 (2007).
- Steven, N. M., Annels, N. E., Kumar, A., Leese, A. M., Kurilla, M. G., Rickinson, A. B. Immediate early and early lytic cycle proteins are frequent targets of the Epstein-Barr virus-induced cytotoxic T cell response. J. Exp. Med. 185, 1605-1617 (1997).
- Luke, J., Carnes, A. E., Hodgson, C. P., Williams, J. A. Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system. Vaccine. 27, 6454-6459 (2009).
- Williams, J. A., Luke, J., Johnson, L., Hodgson, C. pDNAVACCultra vector family: high throughput intracellular targeting DNA vaccine plasmids. Vaccine. 24, 4671-4676 (2006).
- Vera, J. F., Brenner, L. J., Gerdemann, U., Ngo, M. C., Sili, U., Liu, H., Wilson, J., Dotti, G., Heslop, H. E., Leen, A. M., Rooney, C. M. Accelerated production of antigen-specific T-cells for pre-clinical and clinical applications using Gas-permeable Rapid Expansion cultureware (G-Rex. Journal of Immunotherapy. , Forthcoming (2009).
- Vella, A. T., Dow, S., Potter, T. A., Kappler, J., Marrack, P. Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3810-3815 (1998).
- Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J. Exp. Med. 186, 325-330 (1997).
- Heslop, H. E., Ng, C., Li, Y. C., Smith, C., A, C., Loftin, S. K., Krance, R. A., Brenner, M. K., Rooney, C. M. Long-term restoration of immunity against Epstein-Barr virus infection by adoptive transfer of gene-modified virus-specific T lymphocytes. Nature Medicine. 2, 551-555 (1996).
- Rooney, C. M., Smith, C. A., Ng, C., Loftin, S. K., Li, C., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E. Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr virus-related lymphoproliferation. Lancet. 345, 9-13 (1995).
- Einsele, H., Roosnek, E., Rufer, N., Sinzger, C., Riegler, S., Loffler, J., Grigoleit, U., Moris, A., Rammensee, H. G., Kanz, L., Kleihauer, A., Frank, F., Jahn, G., Hebart, H. Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood. 99, 3916-3922 (2002).
- Walter, E. A., Greenberg, P. D., Gilbert, M. J., Finch, R. J., Watanabe, K. S., Thomas, E. D., Riddell, S. R. Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N. Engl. J. Med. 333, 1038-1044 (1995).
