Summary
の世代のための迅速、簡単かつコスト効率の良いプロトコルドナー由来のCMV、前売またはEBV感染症を発症する危険性がある同種造血幹細胞移植（HSCT）の受信者に注入するためmultivirus特異的CTL（rctlを）。この製造プロセスはGMPに準拠しており、専門センターを超えてT細胞免疫療法の広範な実施を確保すべきである。
Abstract
ウイルス感染症は同種造血幹細胞移植（HSCT）受信者の罹患率と死亡率を引き起こす。我々と他の人が正常に生成し、エプスタインバーウイルス（EBV）、サイトメガロウイルス（CMV）と単球とを用いてアデノウイルス（ADV）のためのT -細胞特異的に注入しているEBV形質転換リンパ芽球様細胞を（EBV - LCL）アデノウイルスベクターでの遺伝子的に修飾された抗原提示細胞（APC）。として注入した後、いくつかのログで増殖した2 × 10 5 / kgのtrivirus特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）などのいくつかと他の利用可能な治療法に耐性をさらに深刻なウイルス性疾患の予防と治療に見えた。準備のための - この励みアプローチの広範な実装は、高い生産コスト、製造の複雑さと長時間（合計10〜14週CTLを製造するためのEBV - LCLの生成、および4-8週間4-6週間）によって制限されます。これらの制限を克服するために我々は新しい、GMP準拠のCTL生産のプロトコルを開発しました。最初に、我々は抗原提示のようなDNAプラスミドエンコーディングLMP2、EBNA1とBZLF1（EBV）、ヘキソンとペントン（前売）、およびpp65をとIE1（CMV）とnucleofected樹状細胞（DC）を使用するT細胞を刺激するadenovectorsの代わりに細胞。これらのAPCは、すべての刺激的な抗原に特異的なT細胞を再アクティブ化します。第二に、文化はIL - 4の存在下でT細胞を活性化（1,000 U / ml）とIL - 7（10ng/ml）が増加し、私たちの行で特定のT細胞のレパートリーと周波数を維持します。第三に、我々はこのようにEBV - LCLSのための要件を削除し、技術者の介入を減らし、単一の刺激の後に大規模な細胞数の拡大と生存を促進する新しい、ガス透過性培養装置を（G -レックス）を使用しています。これらの変更を実装することによって我々は今> 90％削減され10 6細胞あたりのコストで、EBV、CMV、および前売をターゲットと多重CTLを生成し、可能な追加するために拡張できるアプローチを使用してわずか10日ではなく10週間で防御ウイルス抗原。私たちのFDA承認のアプローチは、リスクの高い同種HSCTレシピエントの予防と治療のアプリケーションのための値である必要があります。
Protocol
1。直流nucleofection
- セルGenix IL4（1000U/ml）を添加したメディア、GMCSF（800IU/ml）、さらに、DCの成熟のサイトカインIL4を（1000Uを使用して24時間熟成を使用して5日間培養プラスチック接着を、使用して濃縮されている収穫単球由来樹状細胞、 / ml）を、GMCSF（800IU/ml）、IL6100ng/ml、TNF -α10ng/ml、IL1 -β10ng/mlとPGE2（1μg/mlの）1、3ミリリットルの転送ピペットで穏やかに再懸濁による。
- トリパンブルー、ないより少ない6 0.5 × 10以上と3倍の15ミリリットルチューブに転送し、これ以上の6 × 10以上の細胞/チューブを使用して実行可能な樹状細胞を数える。
- 10分@ 200グラムのための樹状細胞を遠心する。 37℃/ 5％CO 2インキュベーターでプレートを扱う12ウェル組織培養の3つのウエルに2ml/well -この時間の間に事前に暖かいセルGenixメディアは、DCの成熟のサイトカイン（DC成熟のメディア）を補充した。
- 一度細胞が回転し終わったら、上清を吸引し、5μgのDNA /チューブの最終濃度で管のそれぞれに関連するDNAプラスミドを追加します。この場合、チューブ＃3をコードするプラスミドチューブ＃1、ヘキソン-ペントン管に＃2〜IE1 - pp65を、およびEBNA1 - LMP2 - BZLF1を追加します。
- Amaxaのnucloefection液の100μLと再懸樹状細胞とDNAには、よく混ぜるとnucleofectionのキュベットに移す。
- 4D nucleofectorの場所のキュベットは、プログラムCB150（Amaxa /ロンザ）を選択し、スタートを押してください。
- nucleofectionがキュベットに2ミリリットル予め温めておいたセルGenix DCの成熟のメディアの500μLを追加した直後は、上下に2〜3回ピペッティングにより穏やかに混合し、あらかじめ温めておいたの残りの1.5mlを含む調製12ウェルプレートにnucleofected DCを転送するDCの成熟のメディア。 37譲渡℃/ 5％CO 2インキュベーターをさらに12 - 18hrsのために。
2。 T細胞刺激
- 収穫と30Gyでnucleofected DCをカウントし、照射。 CTLの培地10mlの（45％RPMI、45％のクリック数EHAA、10％FBS、2mMのグルタミン）とCTLメディアのmlあたり再懸@ 3 × 10 5のDCで1回洗浄します。
- プール各プラスミドを含む樹状細胞の7.5x10 5の最小値（2.5ミリリットル）と15x10 5の最大値（5ml）をして、インキュベータ内に配置されるG -レックスのデバイスにプールされたDCを転送する。
- 応答細胞の調製については以前に凍結末梢血またはDCの選択（遵守またはCD14選択）した後に残っている非接着単核細胞のいずれかを使用してください。細胞を解凍、温めておいた培地に移す、CTL媒体で1回洗浄します。 CTLメディアで細胞を再懸濁し、細胞をカウントし、mlあたり2 × 10 6細胞の濃度にそれらをもたらす。 30000U IL4と15x10 6個の細胞または7.5ミリリットルとサプリメントを（。1000U/ml -最終濃度）に乗り、300ng IL7（10ng/ml -最終濃度。）。
- G -レックスと30ミリリットルの合計体積に対するCTLメディアとバイオリアクターまでトップにPBMCの7.5ミリリットルを（15x10 6個の細胞）に転送します。
- 文化37の6-7日のためのG -レックス℃/ 5％CO 2の加湿インキュベーター。
3。 T細胞の拡大
- 日6-7、メディアの吸引10ミリリットルで、その後10ミリリットルピペットでメディアの残りの20ミリリットルの細胞を混合し、トリパンブルーを用いて生細胞を数える。ある場合は<50x10 6は新鮮な培地+サイトカインを補給。 > 50x10 6個の細胞が存在する場合、細胞懸濁液10mlのを削除し、新しいG - Rexに転送し、新鮮なCTLメディア+サイトカインとの両方G -レックスズを養う。
- 追加の4-6日の培養。一度十分な細胞は、将来使用するためにCTLと低温保存する過剰の表現型および機能解析を行う、拡張されています。
4。代表的な結果：
私たちのFDA承認multivirus特異的CTL生成プロセスの概略図を図1に示されています。ウイルス反応性T細胞を刺激するadenovectorsとEBV - LCLを使用する慣習multivirus CTLのプロトコルには対照2では我々はDNAプラスミドを感染性ウイルスの材料を交換したそのウイルス3のそれぞれから派生する複数の抗原をコード化する。 trivirusのCTLを刺激するために我々は3つのmulticistronicプラスミドエンコーディングヘキソンとペントンアデノウイルスの、CMVのIE1およびpp65を、およびEBNA1、LMP2、およびEBVのBZLF1を設計した。これらの抗原は、私たち自身の細胞やT細胞は、ADV -ヘキソンとペントン2,4-6に対して向けられることを示す他のグループの臨床結果を奨励し、CMV - 1E1、およびCMV - pp65をに基づいて選択された生体 7 の保護です。 EBVの場合、EBNA1は免疫CD4 +すべてのEBV関連悪性腫瘍で、通常のEBVに感染したB細胞で発現するT細胞の標的抗原である8,9、LMP2は、複数のHLAタイプにわたり、免疫原性であり、ほとんどのEBV悪性腫瘍に発現し、10,11 BZLF1中ほとんどの個体からのCD4 +およびCD8 + T細胞を刺激し、共同のために可能性が重要である免疫、即時初期の溶菌サイクルの抗原をコードしているウィルス12複製細胞のntrol。さらに私たちの製造方法を最適化するために我々は、CTL刺激13,14用minimalized、抗生物質フリー（FDA準拠）プラスミドを生成したネイチャーテクノロジーとのコラボレーション。としてIFNγのELISPOTにより測定された最適化されたDNAプラスミドに応答して高い細胞生存率（データは示していない）3。 図2に示すように、ウイルス特異的T細胞のその周波数を維持しながら、我々は一貫して> 35％のnucleofection効率を達成するため、この戦略を使用して、大きい同じ抗原（N = 8アデノウイルスは、n = 4 CMV、およびn = 2 EBV）を発現する従来のpShuttleベースの発現プラスミドへの応答に比べて。 Rの比（n = 2のドナー）：DCの最適な比率：1:50の比は1：20 Sに比べて準最適な活性化を生成した図3に示すように、PBMCは、強力なT細胞刺激のために重要であった。広範な抗原特異性を有する十分なCTLの数値の生産は、すべての3つのウイルスに対する臨床的有効性の前提条件です。これは、 図4Bに示すように、文化へのIL4とIL7の加算がレパートリーと特異性を増加させる一方、従来の24ウェルプレート（ 図4A）15 日と比較して優れたT細胞の拡張をサポートするG -レックス、でCTL培養することによって達成されるCMV - pp65を由来HLA - A2に対する反応性T細胞の頻度がrestictedどこNLVペプチドは、IL4および/ またはIL7 16,17の存在下または非存在下で生成された文化で評価した。我々はフローサイトメトリー解析、細胞内サイトカイン染色/IFNγELISPOT、および凍結保存/注入のための最終的な製品でCR 51放出アッセイを実行する拡張された細胞の表現型および機能的能力を評価する。一般的に生成された細胞はCD4 +および両方のT細胞区画において検出可能な抗原特異性CD8 + T細胞の混合集団とポリクローナルです。 CTLは、 生体内 （ 図5） に移植片対宿主病（GVHD）を誘導してはならないことを示す、ウイルス部分的にHLA一致の目標負ではないウイルス抗原を発現する標的細胞を殺すができるようになりました。
図1。rctlの生成プロトコル。最初に、樹状細胞は、ウイルス抗原をコードするプラスミドでnucleofectedし、Rにおける自家末梢血単核球と混合される：10または20:1のS。細胞は、その後、収穫、IL4とIL7の存在下で10〜14日間G -レックスに拡大して数え、機能、アイデンティティーと不妊の検査、およびその後の臨床使用のために凍結保存されています。
図2。最適化されたDNAプラスミドは 、in vitro での優れたT細胞の活性化を誘発する。 DCは、最適化、FDAに準拠したプラスミド符号化ヘキソンとペントン（前売）、IE1およびpp65を（CMV）、およびEBNA1、LMP2、そしてBZLF1（EBV）または同じ抗原をコードする従来のpShuttleプラスミドでnucleofectedていた。これらはT細胞を刺激するために使用され、特異性は、IFNγのELISPOT 10日のポスト刺激により分析した。
図3最適なDC：。CTL活性化のためのT細胞の比率。 2ドナーからの樹状細胞は、すべての3つの最適化されたプラスミドをnucleofectedしてから、1：20または1:50 DCで自家末梢血単核球を刺激するために使用されていました：PBMCの比率。再活性化T細胞の頻度は、IFNγのELISPOTにより、10日目に評価した。
図4。高めるサイトカインを用いたG -レックスのT細胞の拡大。パネルは、G -レックスのデバイスと同様に顕微鏡で評価したガス透過性膜、上のCTL外観を示しています。プレートVS G -レックス扱わ大会の組織培養で得セルの出力との間の比較も示されています。パネルBは、無サイトカインの存在下で拡大培養において達成CMV量体正のCTL、単独でIL4、IL7アローンおよびIL4 + IL7の周波数を示しています。
図5。拡張されたCTLの表現型と機能。とCD8 +（42％ -細胞毒性） - パネルには、CD4 +（ヘルパー45％）の混合物とのポリクローナルな拡張multivirus CTLの表現型の代表的な例を示してT大多数（95％）が発現し、そのうちの細胞、メモリマーカーCD45RO + / CD62L +。 パネルBは、これらの細胞はすべての刺激抗原に特異的であり、IFNγの産生と抗原刺激後にTNFαを検出するために細胞内サイトカイン染色によって評価される多官能性であることを示しています。 パネルCは、拡張されたCTLは、測定されたとして機能していることを示していますCR 51アッセイによる。自家単独で、またはヌルベクトルまたはCMV - pp65をを発現するアデノウィルスベクターで形質LCLは、タールとして使用された取得。同種反応性は、ターゲットとして同種のPHA芽球を用いて評価した。
Discussion
ウイルス感染症は、自分の病気やその治療によって免疫不全患者ではかなりの罹患率と死亡率を占めている。 HSCT後は、例えば、EBVやCMV、だけでなく、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）などの呼吸器系ウイルスなどによって永続的なヘルペスウイルスによって引き起こされる感染症は、よく、知られているが、前売、BKウイルスによって引き起こされる感染症の重要性、そして人間のヘルペスウイルス（HHV）-6は、最近では評価されている。薬理学的薬剤はいくつかの感染症の標準治療であるが、彼らは実質的な毒性を持って、耐性変異株を生成し、そして頻繁に無効である。対照的に、幹細胞のドナー由来のウイルス特異的T細胞は、造血幹細胞移植（HSCT）の設定2,5,6,18-21のウイルス感染や病気の予防と治療のために安全かつ効果的であることが証明されている。しかし、T細胞免疫療法の広範な実装は、最終的にCTL産生に必要なコスト、複雑さと時間によって制限されます。
現在の原稿に記載されてmultivirus CTLを生成するために私たちの斬新かつ迅速なアプローチは、実質的に免疫不全宿主の標準治療になるための戦略を可能にする、ウイルス性疾患に対する細胞傷害性T細胞治療の実現可能性を増やす必要があります。 APCのようなプラスミドnucleofected DCの使用は、異なるDC集団はそれぞれのプラスミド3用に利用されているため、単一細胞内で発現している複数のウイルス抗原から実際にウイルスベクターやから競争することなくMHCクラスIおよびIIの両方に抗原提示を可能にします。 IL - 4月7日の使用も拡大しそれに応じて抗原特異的T細胞16,17の応答の頻度とレパートリーを増やすに役立つT細胞の生存や増殖、。最後に、G -レックスの文化は劇的に培養中のT細胞のアポトーシスを減らすことができます。ガス交換（のO 2とCO 2のうちは）より多くの栄養素を供給し、廃棄物を希釈し、細胞を上記培地の深みを許可しながら、低酸素症を防止する、フラスコの底にガス透過性のシリコン膜を横切って発生します。このプラットフォームはまた、防御抗原が同定されている場合など、追加のウイルスに拡張することができます。
Disclosures
フアンF.ベラは、ウィルソンウルフの製造のためのコンサルタントです。他の著者は、関連する開示はない。
Acknowledgments
この作品は、細胞治療（契約NIH - NHLBI（HB - 10 - 03）HHSN26820100000C）（CMR）、細胞ベースの治療のための専門センターの生産支援によってサポートされている補助金NIH - NHLBI 1 U54 HL081007（CMR）、ASBMT若手研究者賞（UGおよびJV）、臨床研究賞（UG）の白血病とリンパ腫協会特別研究員、およびエイミーStrelzer Manasevit Scholarの賞（AML）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellGenix | CellGenix | 2005 | |
| IL4 | R&D Systems | 204-IL/CF | |
| IL7 | PeproTech Inc | 200-15 | |
| Hyclone RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30096.01 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical, Inc. | HP1022 | |
| Nucleofector | Amaxa | AAF-1001B & AAF-1001X | |
| Nucleofection Kit | Amaxa | V4XP-3012 | |
| Plasmids | NTC | n/a | |
| GM-CSF | R&D Systems | 215-GM/CF | |
| IL1 | R&D Systems | 201-LB-025 | |
| IL6 | R&D Systems | 206-IL-CF | |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| PGE2 | Sigma-Aldrich | P6532-1MG | |
| G-Rex | Wilson Wolf Manufacturing | AY11-00027 |
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