Summary
En snabb, enkel och kostnadseffektiv protokoll för generering av givare som härrör multivirus-specifik CTL (rCTL) för infusion av allogen hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT) mottagare löper risk att utveckla CMV, Adv eller EBV-infektioner. Denna tillverkningsprocess är GMP-kompatibel och bör se den bredare genomförande av T-cell immunterapi bortom specialiserade centra.
Abstract
Virusinfektioner kan orsaka sjuklighet och dödlighet vid allogen hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT) mottagare. Vi och andra har lyckats genererat och infunderas T-celler specifika för Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) och Adenovirus (ADV) med hjälp av monocyter och EBV-transformerade lymfoblastoida cell (EBV-LCL) genmodifierade med ett adenovirus vektor som antigenpresenterande celler (APC). Så få som 2x10 5 / kg trivirus-specifika cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) frodats av flera stockar efter infusion och verkade att förebygga och behandla även allvarlig virussjukdom resistenta mot andra tillgängliga behandlingar. Det bredare genomförandet av denna uppmuntrande synsätt begränsas av höga produktionskostnader, komplexiteten i tillverkningen och längre tid (4-6 veckor för EBV-LCL generation, och 4-8 veckor för CTL tillverkning - totalt 10-14 veckor) för beredning. För att övervinna dessa begränsningar har vi utvecklat en ny, GMP-kompatibel CTL produktion protokollet. Först, i stället för adenovectors att stimulera T-celler använder vi dendritiska celler (DC) nucleofected med DNA plasmider kodning LMP2, EBNA1 och BZLF1 (EBV), Hexon och Penton (ADV) och pp65 och IE1 (CMV) som antigen-presenterande celler. Dessa APC aktivera T-celler specifika för alla stimulerande antigener. Andra kultur av aktiverade T-celler i närvaro av IL-4 (1000 E / ml) och IL-7 (10ng/ml) ökar och upprätthåller den repertoar och frekvens av specifika T-celler i våra linjer. Det tredje har vi använt en ny, gas permeabla kultur-enhet (G-Rex) som gynnar utvidgning och överlevnad av stora cell nummer efter en enkel stimulering, vilket tar bort kravet på EBV-LCLS och minska tekniker intervention. Genom att implementera dessa förändringar kan vi nu tillverka multispecific CTL riktar EBV, CMV och Adv till en kostnad av 10 6 celler som reduceras med> 90%, och på bara 10 dagar istället för 10 veckor med hjälp av en metod som kan utvidgas till ytterligare skyddande virusantigener. Vår FDA-godkända tillvägagångssätt bör vara av värde för profylaktisk och behandling applikationer för hög risk allogen HSCT mottagare.
Protocol
1. DC nucleofection
- Harvest monocyte-derived utvecklingsländerna, som har berikats med plast följsamhet, odlade i 5 dagar med Cell genix Media kompletteras med IL4 (1000U/ml), GMCSF (800IU/ml) och ytterligare lagrats i 24 timmar med hjälp av DC-mognad cytokiner IL4 (1000U / ml), GMCSF (800IU/ml), IL6100ng/ml, TNF-α 10ng/ml, IL1-β 10ng/ml och PGE2 (1μg/ml) 1, genom varsam resuspension med en 3 ml överföringspipett.
- Räkna livskraftiga DCs med trypan blå, överföring till 3x 15ml tuber med inte mindre än 0.5x10 6 och högst 2x10 6 celler / rör.
- Centrifugera DCs för 10mins @ 200g. Under denna tid förvärma Cell genix media kompletteras med DC mognad cytokiner (DC mognaden media) - 2ml/well i tre brunnar på en 12-och vävnadsodling behandlas plattan i 37 ° C / 5% CO 2 inkubator.
- När cellerna har slutat snurra, aspirera supernatanten och tillsätt relevanta DNA plasmider till var och en av rören i en slutlig koncentration av 5 mikrogram DNA / rör. I detta fall lägga plasmiden kodning IE1-pp65 för att tub # 1, Hexon-Penton för att tub # 2, och EBNA1-LMP2-BZLF1 för att tub # 3.
- Resuspendera utvecklingsländerna och DNA med 100μl av Amaxa nucloefection lösning, blanda väl och transfer till nucleofection kyvetter.
- Placera kyvetter i 4D nucleofector, välj program CB150 (Amaxa / Lonza) och tryck start.
- Omedelbart efter nucleofection lägga 500μl av 2ml förvärmda Cell genix DC mognad media till kyvetten, blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned 2-3 gånger och överföra nucleofected utvecklingsländerna till den förbehandlade 12-brunnar innehåller resterande 1,5 ml uppvärmd DC mognad medier. Transfer till 37 ° C / 5% CO 2 inkubator för ytterligare en 12-18hrs.
2. T-cell stimulering
- Harvest och räkna nucleofected utvecklingsländerna, och bestråla på 30Gy. Tvätta en gång med 10 ml av CTL medelstora (45% RPMI, 45% Klick EHAA, 10% FBS, 2mm Glutamax) och återsuspendera @ 3 x 10 5 DCs per ml CTL medier.
- Pool minst 7.5x10 5 (2,5 ml) och högst 15x10 5 (5 ml) av DCS innehåller varje plasmider och överföra poolade utvecklingsländerna till G-Rex enhet som sedan kommer att placeras i inkubatorn.
- För beredning av responder celler använder antingen tidigare frysta PBMC eller icke-häftande mononukleära celler som återstår efter DC-valet (anslutning eller CD14 urval). Tina cellerna, transfer till uppvärmd odlingsmedium, tvätta en gång med CTL medier. Resuspendera cellerna i CTL Media, räkna celler och föra dem till en koncentration av 2x10 6 celler per ml. Ta 15x10 6 celler eller 7.5ml och komplettera med 30000U IL4 (1000U/ml -. Slutlig conc) och 300ng IL7 (10ng/ml - slutlig konc.).
- Överföring 7.5ml av PBMC (15x10 6 celler) till G-Rex och fyll på bioreaktor med CTL media till en total volym på 30 ml.
- Kultur G-Rex i 6-7 dagar i 37 ° C / 5% CO 2 fuktad inkubator.
3. T-cell expansionen
- På dag 6-7, aspirera 10ml av media, blanda sedan de celler i de återstående 20 ml av media med en 10 ml pipett och räkna livsdugliga celler med hjälp av trypan blå. Om det är <50x10 6 fylla på med nya medier + cytokiner. Om det är> 50x10 6 celler bort 10 ml cellsuspension, förflyttas till en ny G-Rex, och sedan mata både G-Rexs med färsk CTL media + cytokiner.
- Kultur för ytterligare 4-6 dagar. Så snart tillräckliga celler har utökats, utföra fenotypiska och funktionell karakterisering av CTL och cryopreserve överskott för framtida bruk.
4. Representativa resultat:
En schematisk av våra FDA-godkända multivirus-specifik CTL generationens process visas i figur 1. I motsats till konventionen multivirus CTL protokoll som använder adenovectors och EBV-LCL att stimulera virus-reaktiva T-celler 2 har vi ersatt infektiösa virus material med DNA plasmider som kodar för flera antigener härrör från var och en av virus 3. För att stimulera trivirus CTL vi utformat tre multicistronic plasmider kodning Hexon och Penton av adenovirus, IE1 och pp65 av CMV och EBNA1, LMP2 och BZLF1 av EBV. Dessa antigener valdes utifrån uppmuntrande kliniska resultat av våra egna och andra grupper som visar att T-celler riktade mot ADV-hexon och Penton 2,4-6, och CMV-1E1 och CMV-pp65 är skyddande in vivo 7. För EBV är EBNA1 en immunodominant epitop från autoantigenet CD4 + T celler målantigenet uttrycks i alla EBV-associerade maligniteter och vid normal EBV-infekterade B-celler 8,9, LMP2 är immunogent över flera typer av HLA och uttrycks i de flesta EBV maligniteter, 10,11 medan BZLF1 kodar en immunodominant epitop från autoantigenet, omedelbar tidigt lytisk cykel antigen som stimulerar både CD4 + och CD8 + T-celler från de flesta individer och är sannolikt viktig för samarbetetntrol av celler replikera virus 12. För att ytterligare optimera våra tillverkningsmetoder vi samarbetat med Natur-teknik som genereras minimalized, antibiotika-fria (FDA-kompatibel) plasmider för CTL stimulering 13,14. Med denna strategi vi uppnå genomgående nucleofection effektivitet på> 35% med bibehållen hög cellviabiliteten (data visas ej) 3. Figur 2 visar att frekvensen av virus-specifika T-celler som svar på optimerade DNA plasmider mätt med IFNγ ELISPOT, var större än svar på konventionell pShuttle-baserade uttryck plasmider som uttrycker samma antigener (n = 8 Adenovirus, n = 4 CMV, och n = 2 EBV). Det optimala förhållandet mellan DC: PBMC var viktigt för potenta T-cell stimulering som visas i figur 3, där förhållandet 01:50 producerade suboptimal aktivering jämfört med en 1:20 S: R-förhållande (n = 2 givare). Produktion av tillräckligt CTL tal med bred antigenspecificitet är en förutsättning för klinisk effekt mot alla tre virus. Detta uppnås genom CTL kultur i G-Rex, som stöder överlägsen T-cell Ökningen jämfört med konventionella 24-brunnars plattor (Figur 4A) 15, medan tillsats av IL4 och IL7 att kulturer ökar repertoaren och specificitet som visas i figur 4B När frekvensen av T-celler reaktiva mot CMV-pp65-derived HLA-A2 resticted NLV peptid bedömdes i kulturer som genereras i närvaro eller frånvaro av IL4 och / eller IL7 16,17. För att bedöma fenotyp och funktionsförmåga den utökade celler vi utför flödescytometrisk analys, intracellulär cytokin färgning / IFNγ ELISPOT, och Cr 51 analyser släppa på den slutliga produkten för frysförvaring / infusion. Typiskt genereras cellerna polyklonala med en blandad befolkning av CD4 + och CD8 + T celler med antigen-specificitet detekteras i både T-cell fack. Den CTL kan döda virusantigen-uttryckande målceller men inte virus negativa delvis HLA matchas mål, vilket indikerar att de inte skulle få graft-versus-host sjukdom (GvHD) in vivo (Figur 5).
Figur 1. RCTL generation protokollet. Först är Utvecklingsländerna nucleofected med virusantigen-kodning plasmider och sedan blandas med autolog PBMC på en R: S om 10 eller 20:01. Celler byggs ut i G-Rex i 10-14 dagar i närvaro av IL4 och IL7, sedan skördas, räknas, testas för funktion, identitet och sterilitet, och sedan frysförvarade för klinisk användning.
Figur 2. Optimerad DNA plasmider framkalla överlägsen T-cell aktivering in vitro. Utvecklingsländerna var nucleofected med optimerade, FDA-kompatibel plasmider kodning Hexon och Penton (ADV), IE1 och pp65 (CMV) och EBNA1, LMP2 och BZLF1 (EBV) eller konventionellt plasmider pShuttle kodning samma antigener. Dessa användes för att stimulera T-celler och specificiteten analyserades med IFNγ ELISPOT 10 dagar efter stimulering.
Figur 3 Optimal DC:. T-cell-tal för CTL aktivering. Utvecklingsländerna från 2 givare nucleofected med alla tre optimerade plasmider och sedan används för att stimulera autologa PBMC kl 1:20 eller 1:50 DC: PBMC förhållande. Frekvensen av aktiveras T-celler bedömdes på dag 10 av IFNγ ELISPOT.
Figur 4. T-cell expansion i G-Rex med ökad cytokiner. Panel A visar G-Rex enheten samt CTL utseende på gasen membran, utvärderas av mikroskopi. En jämförelse mellan cellens produktion uppnås i konventionen vävnadsodling behandlade plattor vs G-Rex visas också. Panel B visar frekvensen av CMV pentamer positiva CTL uppnås i kulturer expanderat i närvaro av någon cytokin, IL4 ensam, IL7 ensam och IL4 + IL7.
Figur 5. Fenotyp och funktion av expanderad CTL. Panel A visar ett representativt exempel på fenotyp av den utvidgade multivirus CTL, som är polyklonala med en blandning av CD4 + (45% - hjälpare) och CD8 + (42% - cytotoxiska) T-celler, varav en majoritet (95%) uttryckte minne markör CD45RO + / CD62L +. Panel B visar att dessa celler är specifika för alla stimulerande antigener och Polyfunktionella som bedöms av intracellulär cytokin färgning att upptäcka produktion av IFNΓ och TNF efter antigen stimulering. Panel C visar att den utökade CTL är funktionella mätt av Cr 51-analysen. Autolog LCL, antingen ensam eller transduced med ett null-vektor-eller en adenovirala vektor som uttrycker CMV-pp65 användes som tjärafår. Alloreactivity bedömdes med hjälp allogen PHA blaster som mål.
Discussion
Virusinfektioner står för betydande morbiditet och mortalitet hos patienter som är immunsupprimerade genom sin sjukdom eller dess behandling. Efter HSCT, till exempel infektioner orsakade av ihållande herpesvirus som EBV och CMV, liksom av respiratoriska virus som respiratoriskt syncytialvirus (RSV), välkänd, medan betydelsen av infektioner orsakade av Adv, BK-virus, och mänskliga herpesvirus (HHV) har -6 senare tid varit uppskattat. Medan farmakologiska agenter är standardbehandling för vissa infektioner, de har en betydande toxicitet, skapa resistenta varianter, och ofta ineffektiva. Däremot har virus-specifika T-celler från stamcellsdonatorer bevisat säker och effektiv för förebyggande och behandling av virusinfektion eller sjukdom i hemopoietic stamcellstransplantation (HSCT) inställning 2,5,6,18-21. Är dock bredare genomförandet av T-cell immunterapi ytterst begränsas av kostnaden, komplexiteten och tiden som krävs för CTL produktion.
Vår nya och snabb metod för att generera multivirus CTL, som beskrivs i den aktuella manuskriptet, bör kraftigt öka möjligheten att cytotoxiska T cellterapi för virussjukdomar, vilket gör att strategi att bli en standardbehandling för patienter med nedsatt immunförsvar värd. Användningen av plasmid nucleofected utvecklingsländer som APC gör antigen presentation på både MHC klass I och II, utan konkurrens från virala vektorer eller ens från flera virusantigener uttrycks i en enda cell eftersom olika DC populationer används för varje plasmid 3. Användning av IL-4 / 7 ökar T-cell överlevnad och spridning, vilket motsvarande hjälper till att öka frekvensen och repertoar av svar antigen-specifika T celler 16,17. Slutligen minskar kultur i G-Rex dramatiskt T-cell apoptos under kultur. Gasutbyte (O 2 i och CO 2 ut) sker över en gas permeabla kisel membran vid basen av kolven, förebygga syrebrist samtidigt som ett större djup i media över cellerna, ger mer näringsämnen och späda ut slaggprodukter. Denna plattform kan även utvidgas till ytterligare virus som när skyddande antigen identifieras.
Disclosures
Juan F. Vera är konsult för Wilson Wolf Manufacturing. Den andra författare har inga relevanta upplysningar.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av ett Produktion Stöd för cellulära terapier (kontrakt NIH-NHLBI (HB-10-03) HHSN26820100000C) (CMR), ett specialiserat center för Cell-baserad terapi Grant NIH-NHLBI 1 U54 HL081007 (CMR), en ASBMT Young Investigator Award (UG och JV), en leukemi och lymfom Society Special Fellow i Clinical Research Award (UG) och en Amy Strelzer Manasevit Scholar Award (AML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellGenix | CellGenix | 2005 | |
| IL4 | R&D Systems | 204-IL/CF | |
| IL7 | PeproTech Inc | 200-15 | |
| Hyclone RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30096.01 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical, Inc. | HP1022 | |
| Nucleofector | Amaxa | AAF-1001B & AAF-1001X | |
| Nucleofection Kit | Amaxa | V4XP-3012 | |
| Plasmids | NTC | n/a | |
| GM-CSF | R&D Systems | 215-GM/CF | |
| IL1 | R&D Systems | 201-LB-025 | |
| IL6 | R&D Systems | 206-IL-CF | |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| PGE2 | Sigma-Aldrich | P6532-1MG | |
| G-Rex | Wilson Wolf Manufacturing | AY11-00027 |
References
- Kaka, A. S., Foster, A. E., Weiss, H. L., Rooney, C. M., Leen, A. M. Using dendritic cell maturation and IL-12 producing capacity as markers of function: a cautionary tale. J Immunother. 31, 359-369 (2008).
- Leen, A. M., Myers, G. D., Sili, U., Huls, M. H., Weiss, H., Leung, K. S., Carrum, G., Krance, R. A., Chang, C. C., Molldrem, J. J. Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals. Nat. Med. 12, 1160-1166 (2006).
- Gerdemann, U., Christin, A. S., Vera, J. F., Ramos, C. A., Fujita, Y., Liu, H., Dilloo, D., Heslop, H. E., Brenner, M. K., Rooney, C. M., Leen, A. M. Nucleofection of DCs to generate Multivirus-specific T cells for prevention or treatment of viral infections in the immunocompromised host. Mol. Ther. 17, 1616-1625 (2009).
- Leen, A. M., Christin, A., Khalil, M., Weiss, H., Gee, A. P., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. Identification of hexon-specific CD4 and CD8 T-cell epitopes for vaccine and immunotherapy. J Virol. 82, 546-554 (2008).
- Leen, A. M., Christin, A., Myers, G. D., Liu, H., Cruz, C. R., Hanley, P. J., Kennedy-Nasser, A. A., Leung, K. S., Gee, A. P., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. Cytotoxic T lymphocyte therapy with donor T cells prevents and treats adenovirus and Epstein-Barr virus infections after haploidentical and matched unrelated stem cell transplantation. Blood. 114, 4283-4292 (2009).
- Feuchtinger, T., Matthes-Martin, S., Richard, C., Lion, T., Fuhrer, M., Hamprecht, K., Handgretinger, R., Peters, C., Schuster, F. R., Beck, R., Schumm, M., Lotfi, R., Jahn, G., Lang, P. Safe adoptive transfer of virus-specific T-cell immunity for the treatment of systemic adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. Br J Haematol. 134, 64-76 (2006).
- Bunde, T., Kirchner, A., Hoffmeister, B., Habedank, D., Hetzer, R., Cherepnev, G., Proesch, S., Reinke, P., Volk, H. D., Lehmkuhl, H., Kern, F. Protection from cytomegalovirus after transplantation is correlated with immediate early 1-specific CD8 T cells. J. Exp. Med. 201, 1031-1036 (2005).
- Leen, A., Meij, P., Redchenko, I., Middeldorp, J., Bloemena, E., Rickinson, A., Blake, N. Differential immunogenicity of Epstein-Barr virus latent-cycle proteins for human CD4(+) T-helper 1 responses. J Virol. 75, 8649-8659 (2001).
- Bickham, K., Munz, C., Tsang, M. L., Larsson, M., Fonteneau, J. F., Bhardwaj, N., Steinman, R. EBNA1-specific CD4+ T cells in healthy carriers of Epstein-Barr virus are primarily Th1 in function. J. Clin. Invest. 107, 121-130 (2001).
- Straathof, K. C., Leen, A. M., Buza, E. L., Taylor, G., Huls, M. H., Heslop, H. E., Rooney, C. M., Bollard, C. M. Characterization of latent membrane protein 2 specificity in CTL lines from patients with EBV-positive nasopharyngeal carcinoma and lymphoma. J. Immunol. 175, 4137-4147 (2005).
- Hislop, A. D., Taylor, G. S., Sauce, D., Rickinson, A. B. Cellular responses to viral infection in humans: lessons from Epstein-Barr virus. Annu. Rev. Immunol. 25, 587-617 (2007).
- Steven, N. M., Annels, N. E., Kumar, A., Leese, A. M., Kurilla, M. G., Rickinson, A. B. Immediate early and early lytic cycle proteins are frequent targets of the Epstein-Barr virus-induced cytotoxic T cell response. J. Exp. Med. 185, 1605-1617 (1997).
- Luke, J., Carnes, A. E., Hodgson, C. P., Williams, J. A. Improved antibiotic-free DNA vaccine vectors utilizing a novel RNA based plasmid selection system. Vaccine. 27, 6454-6459 (2009).
- Williams, J. A., Luke, J., Johnson, L., Hodgson, C. pDNAVACCultra vector family: high throughput intracellular targeting DNA vaccine plasmids. Vaccine. 24, 4671-4676 (2006).
- Vera, J. F., Brenner, L. J., Gerdemann, U., Ngo, M. C., Sili, U., Liu, H., Wilson, J., Dotti, G., Heslop, H. E., Leen, A. M., Rooney, C. M. Accelerated production of antigen-specific T-cells for pre-clinical and clinical applications using Gas-permeable Rapid Expansion cultureware (G-Rex. Journal of Immunotherapy. , Forthcoming (2009).
- Vella, A. T., Dow, S., Potter, T. A., Kappler, J., Marrack, P. Cytokine-induced survival of activated T cells in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3810-3815 (1998).
- Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J. Exp. Med. 186, 325-330 (1997).
- Heslop, H. E., Ng, C., Li, Y. C., Smith, C., A, C., Loftin, S. K., Krance, R. A., Brenner, M. K., Rooney, C. M. Long-term restoration of immunity against Epstein-Barr virus infection by adoptive transfer of gene-modified virus-specific T lymphocytes. Nature Medicine. 2, 551-555 (1996).
- Rooney, C. M., Smith, C. A., Ng, C., Loftin, S. K., Li, C., Krance, R. A., Brenner, M. K., Heslop, H. E. Use of gene-modified virus-specific T lymphocytes to control Epstein-Barr virus-related lymphoproliferation. Lancet. 345, 9-13 (1995).
- Einsele, H., Roosnek, E., Rufer, N., Sinzger, C., Riegler, S., Loffler, J., Grigoleit, U., Moris, A., Rammensee, H. G., Kanz, L., Kleihauer, A., Frank, F., Jahn, G., Hebart, H. Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. Blood. 99, 3916-3922 (2002).
- Walter, E. A., Greenberg, P. D., Gilbert, M. J., Finch, R. J., Watanabe, K. S., Thomas, E. D., Riddell, S. R. Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N. Engl. J. Med. 333, 1038-1044 (1995).
