Summary
L'induction d'électrolyse de l'activation endothéliale à la surface interne de la veine cave inférieure des résultats dans la formation de thrombus veineux de type due à l'activation endothéliale et de sang partielle stase, deux composantes de la triade de Virchow.
Abstract
Les modèles animaux jouent un rôle essentiel dans la thrombose veineuse profonde (TVP) de recherche afin d'étudier la formation de thrombus, la résolution du thrombus et de tester le potentiel des composés thérapeutiques (1). De nouveaux composés pour être utilisé dans le traitement et la prévention de la TVP sont en cours d'élaboration. La livraison des composés antagonistes potentiels thérapeutiques pour une thrombose veineuse affectés a été problématique. Dans le contexte des applications thérapeutiques, un modèle qui utilise partielle stase et génère constamment thrombus dans une veine majeure a été récemment créé. La veine cave inférieure électrolytique modèle (EIM) est un modèle de souris de TVP qui permet la formation de thrombus dans la présence d'un flux sanguin continu. Ce modèle permet d'agents thérapeutiques à être en contact avec le thrombus de façon dynamique, et est plus sensible que d'autres modèles de thrombose veineuse profonde (1). En outre, ce modèle de thrombose simule des situations cliniques de la formation de thrombus et est idéal pour étudier l'activation des cellules endothéliales veineuses, la migration des leucocytes, thrombogénèse veineux, et de tester les applications thérapeutiques (1). Le modèle MIE est techniquement simple, facilement reproductible, crée cohérente tailles thrombus et permet un large échantillon (c.-à thrombus et paroi de la veine) qui est nécessaire aux fins d'analyse.
Protocol
1. Procédures d'anesthésie de la souris
- Les animaux sont retirés de leur cage et placé dans une chambre d'induction anesthésique pré-opératoire pour l'induction de gaz à 2% d'isoflurane et 100% d'oxygène à un débit de 0,5 litres par minute (vaporisateur contrôlée).
- Les souris sont sous sédation dans la chambre de l'induction anesthésique, retiré de la chambre et l'abdomen ventral est rasée avec une tondeuse électrique, ou maintenu dans la chambre si une épilation des cheveux est utilisé (1 min).
- Alors qu'il était encore sous sédation, ils sont pesés, les yeux sont lubrifiés avec de la pommade ophtalmique stérile et, ensuite placé dans décubitus dorsal sur un dispositif de chauffage d'eau chaude circulant sous anesthésie générale avec un cône de nez à l'aide d'isoflurane et de l'oxygène. A ce point du taux d'oxygène est réduit à 0,2 litres par minute.
- L'abdomen est pulvérisé avec une solution de chlorhexidine (diacétate de chlorhexidine est rapidement bacterialcidal et persistante) et essuyé avec une gaze stérile à trois reprises ou jusqu'à ce que le site chirurgical est propre.
2. Souris micro-chirurgicales et les procédures de récupération
- Une incision médiane ventrale (2 cm) est faite avec des ciseaux iris à travers la peau et la paroi abdominale exposer l'abdomen. Un 2x2 salines stériles trempées dans de la gaze est utilisée pour refléter les intestins à gauche de l'animal. Un dispositif de retenue de la souris est mis en place, permettant la visualisation de la veine cave inférieure (VCI).
- À ce stade, l'isoflurane est réduite à un niveau d'entretien de 2% et le taux d'oxygène reste à 0,2 litres par minute pour le reste de la procédure chirurgicale.
- Dissection est facilitée à l'aide d'un écouvillon applicateur stérile et extra délicats iris pince moitié tissus courbes. Des précautions doivent être prises dans la manipulation des tissus de souris car elles sont extrêmement fragiles.
- Toutes les branches latérales IVC, des veines rénales à la bifurcation iliaque, sont ligués avec 7-0 points de suture Prolène non réactif. Retour branches resté brevet.
- Dans le modèle d'électrolyse IVC (EIM), un acier inoxydable 25G aiguille, attaché à un fil de cuivre recouvert d'argent (KY-30-1-GRN, Electrospec, Dover, New Jersey) est insérée dans l'exposé IVC caudale, (figure 1) et placés contre la paroi antérieure (anode).
- Un autre fil est implanté sous la peau complétant le circuit (la cathode).
- Un courant de 250 μAmps plus de 15 minutes a été appliquée en utilisant un stimulateur de l'herbe S48 onde carrée et une unité de courant constant (Technologies herbe, un Astro-Med, Inc, West Warwick, RI). Les résultats directs actuels dans la formation de produits toxiques de l'électrolyse qui érodent la surface endothéliale de la VCI promouvoir un environnement thrombogène et ultérieures formation de thrombus.
- Après 15 minutes, l'aiguille est retirée et un coton-tige est tenue délicatement en contact avec la zone pour prévenir les saignements
- Chez les animaux de simulacre, l'aiguille est placée dans la VCI et ensuite retiré, sans application du courant.
- Le site est fermé laparotomie dans un mode bi-couche. Notre laboratoire utilise 5-0 Vicryl, une suture synthétique, dans un motif continu de fermer la paroi abdominale. Colle de peau adhésif est utilisé pour fermer la peau. Il n'y a pas sutures externes pour l'enlèvement.
- Les souris sont ensuite récupérés dans une cage de souris individuelle, observé de près en post-opératoire (45 minutes à 2 heures) sous une lampe chauffante (distance minimale de 24 pouces loin de la cage), puis retournèrent à leurs unités de logement d'origine. Médicaments contre la douleur et les agents anti-inflammatoires peuvent être utilisés si elle n'interfère pas avec l'objectif de l'étude. Justification scientifique à retenir médicaments contre la douleur, vétérinaire, et l'approbation ICUCA sont nécessaires. Notre laboratoire a montré que la buprénorphine ,0.05-0 0,1 mg / kg SQ est un excellent analgésique pré-et post-opératoire pour les souris. En outre, lidocaïne au 4mg/kg (0,4 ml / kg d'une solution à 1%) peuvent être infusés dans le site d'incision lors analgésiques systémiques peuvent brouiller les résultats expérimentaux.
- En général, nous ne expérience post-opératoire des effets néfastes dus à la TVP. Toutefois, néfastes post-opératoire effets peuvent inclure la mort spontanée d'anesthésie, les pertes sanguines chirurgicales, et une parésie partielle due à un traumatisme nerveux. Les animaux qui sont lents à récupérer peuvent être alimentés de ragondin gel ou humides ont chow placés sur le plancher de la cage afin de faciliter la récupération de l'animal. Les animaux atteints de rompre les complications post-opératoires doivent être euthanasiés.
- Au point le temps imparti, l'euthanasie est réalisée avec humanité conformément aux recommandations énoncées par l'American Veterinary Medical Association Directives sur l'euthanasie pour les rongeurs.
3. Les résultats représentatifs
L'EIM est un modèle qui forme un thrombus dans la présence d'un flux sanguin continu. Les chiffres suivants montrent les paramètres étudiés dans ce nouveau modèle.
Figure 1 Zone definesthe anatomiques où un 25G en acier inoxydableaiguille, attaché à un fil de cuivre recouvert d'argent (KY-30-1-GRN, Electrospec, Dover, New Jersey) est inséré. Notez que d'un noeud lymphatique est pratiquement présent et contribue à un point de repère pour trouver la caudale IVC.
Figure 2: poids du thrombus deux jours après l'EIM dans les différentes souches. Comme prévu, le poids du thrombus était plus faible dans le PAI-1 souris KO et plus grand dans hypercoagulabilité souris delta CT (^ CT).
Figure 3: la P-sélectine soluble, un fabricant de thrombose veineuse profonde, a été mesurée dans différentes souches. Les niveaux les plus bas ont été trouvés dans le PAI-1 souris KO alors que les niveaux les plus élevés ont été trouvés dans hypercoagulabilité souris CT delta.
Figure 4 Corrélation entre le poids du thrombus et solubles de P-sélectine a été trouvé dans des souches différentes. Fait à noter, dans le groupe qui a généré le plus court de taille du thrombus, la P-sélectine soluble détectée était le plus bas (PAI-1 souris KO). Dans le groupe qui a généré la plus grande taille du thrombus, la P-sélectine soluble détectée était la plus élevée (hypercoagulabilité delta du CT).
Figure 5: Afin de démontrer la présence de la circulation sanguine, une échographie a été réalisée chez des souris subissant MIE. La figure 5 montre l'échographie réalisée dans une souris à 2 jours après l'EIM. Puis l'échantillon a été la récolte. Notez que la forme du thrombus suggèrent la formation de thrombus dans la présence d'un flux
Discussion
La souris est un excellent outil de recherche pour les expériences in vivo. Ainsi, le développement de modèles de souris qui imitent de près les maladies ou états pathologiques sont nécessaires. Plusieurs modèles de thrombose veineuse souris ont été utilisés pour étudier TVP, y compris: photochimiques (2), la stase (3-4) et les traumatismes mécaniques (5-6). Cependant, aucun de ces modèles utilisent un stimulus interne endothéliales pour produire de thrombus dans la présence d'un débit sanguin continu. L'EIM, à l'aide d'électrolyse de relance au sein de l'IVC, favorise thrombogénèse veineuse par l'activation endothéliale, en présence de flux sanguin (1). Il est techniquement simple, facilement reproductible et a un taux de survie élevé (99%). Malgré le fait que le courant électrique est utilisé pour créer l'électrolyse, la chaleur n'est pas produite (1). Le modèle simule l'EIM TVP cliniques, et sert donc comme un outil précieux pour étudier les mécanismes intrinsèques de la formation de thrombus et de la résolution. Le modèle EIM est également utile pour l'avancement de nouvelles approches thérapeutiques contre la maladie d'une thrombose.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Soutenu par le NIH 1P01HL089407-01A1 (Lawrence, PI), des animaux de base A, NIH 1 K01 HL080962-01A2 (Myers, PI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 |
References
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- Eitzman, D. T., Westrick, R. J., Nabel, E. G. Plasminogen activator inhibitor-1 and vitronectin promote vascular thrombosis in mice. Blood. 95, 577-580 (2000).
- Myers, D., Farris, D., Hawley, A. Selectins influence thrombosis in a mouse model of experimental deep venous thrombosis. J Surg Res. 108, 212-221 (2002).
- Myers, D. D., Hawley, A. E., Farris, D. M. P-selectin and leukocyte microparticles are associated with venous thrombogenesis. J Vasc Surg. 38, 1075-1089 (2003).
- Pierangeli, S. S., Barker, J. H., Stikovac, D. Effect of human IgG antiphospholipid antibodies on an in vivo thrombosis model in mice. Thromb Haemost. 71, 670-674 (1994).
- Pierangeli, S. S., Liu, X. W., Barker, J. H. Induction of thrombosis in a mouse model by IgG, IgM and IgA immunoglobulins from patients with the antiphospholipid syndrome. Thromb Haemost. 74, 1361-1367 (1995).
