Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Elektrolytische Inferior Vena Cava Model (EIM) van veneuze trombose

doi: 10.3791/2737 Published: July 12, 2011

Summary

De elektrolytische inductie van endotheel activatie aan het interne oppervlak van de vena cava inferior resulteert in een veneuze soort trombusvorming te wijten aan endotheel activatie en gedeeltelijke bloed stasis, twee componenten van de triade Virchow's.

Abstract

Diermodellen dienen een belangrijke rol in diepe veneuze trombose (DVT) onderzoek met het oog op trombusvorming, trombus resolutie te bestuderen en om potentiële therapeutische stoffen (1) test. Nieuwe verbindingen te worden gebruikt in de behandeling en preventie van DVT worden momenteel ontwikkeld. De levering van potentiële therapeutische antagonist verbindingen aan een getroffen thrombosed ader is problematisch. In het kader van therapeutische toepassingen, een model dat gedeeltelijke stasis gebruikt en consequent genereert trombi binnen een belangrijke ader is onlangs vastgesteld. De elektrolytische vena cava inferior Model (EIM) is muismodel van DVT die trombusvorming in de aanwezigheid van continue bloedstroom mogelijk maakt. Dit model maakt therapeutische middelen om in contact met de trombus op een dynamische manier, en is gevoeliger dan de andere modellen van DVT (1). Daarnaast is deze trombose model simuleert nauw klinische situaties van trombusvorming en is ideaal om veneuze endotheel activatie, migratie van leukocyten, veneuze trombogenese, bestuderen en therapeutische toepassingen (1) test. Het EIM-model is technisch eenvoudig, gemakkelijk reproduceerbaar, creëert consistente trombi maten en zorgt voor een grote steekproef (dat wil zeggen trombus en ader muur) die nodig is voor analytische doeleinden.

Protocol

1. Muis Anesthesie Procedures

  1. Dieren uit hun kooi en geplaatst in een verdovingsmiddel pre-operatieve inductie kamer voor gasinductie op 2% isofluraan en 100% zuurstof bij een debiet van 0,5 liter per minuut (vaporizer gecontroleerd).
  2. Muizen worden verdoofd in de verdoving inductie kamer, verwijderd van kamer en het ventrale buik wordt geschoren met de tondeuse, of onderhouden in de kamer als een haar ontharingscrème wordt gebruikt (1 min).
  3. Hoewel nog steeds onder sedatie, ze zijn gewogen, zijn de ogen gesmeerd met steriele oogzalf, en vervolgens geplaatst in dorsale recumbancy op een warm water circuleert apparatuur voor verwarming van onder algehele narcose met een neus met behulp van isofluraan en zuurstof. Op dit punt de zuurstof tarief wordt verlaagd tot 0,2 liter per minuut.
  4. De buik is bespoten met chloorhexidine-oplossing (chloorhexidine diacetaat wordt snel bacterialcidal en persistent) en veegde met een steriel gaasje drie keer of totdat de operatiewond schoon is.

2. Muis Micro-chirurgische en recovery procedures

  1. Een ventrale middellijn incisie (2 cm) is gemaakt met iris schaar door de huid en de buikwand het blootstellen van de buik. Een steriele zoutoplossing gedrenkt 2x2 in gaas wordt gebruikt om de darmen naar links van het dier kant weer te geven. Een muis restrainer is opgezet zodat visualisatie van de vena cava inferior (IVC).
  2. Op dit punt wordt de isofluraan teruggebracht tot een onderhouds niveau van 2% en de zuurstof percentage blijft op 0,2 liter per minuut voor de rest van de chirurgische procedure.
  3. Stompe dissectie wordt vergemakkelijkt met een steriele applicator staafje en een extra delicate iris half gebogen weefsel tang. Voorzichtigheid is geboden bij het hanteren muisweefsels want ze zijn uiterst kwetsbaar.
  4. Alle IVC zijtakken, van de nier-aders naar de iliacale bifurcatie, worden geligeerd met 7-0 niet-reactief prolene hechtingen. Terug takken bleven patent.
  5. In de elektrolytische IVC model (EIM), een 25G roestvrij stalen naald, bevestigd aan een verzilverd koperdraad (KY-30-1-GRN, Electrospec, Dover, New Jersey) is ingebracht in de blootgestelde caudale IVC, (figuur 1) en geplaatst tegen de voorste muur (anode).
  6. Een andere draad wordt geïmplanteerd subcutaan het invullen van het circuit (kathode).
  7. Een stroom van 250 μAmps meer dan 15 minuten werd toegepast met behulp van een Grass S48 blokgolf stimulator en een constante stroom eenheid (Grass Technologies, een Astro-Med, Inc, West Warwick, RI). De directe stroom resulteert in de vorming van giftige producten van elektrolyse dat de endotheliale oppervlak van het IVC het bevorderen van een trombogene omgeving en de daaropvolgende trombusvorming eroderen.
  8. Na 15 minuten, wordt de naald verwijderd en een wattenstaafje wordt voorzichtig in contact met het gebied om het bloeden te voorkomen
  9. In schijnvertoning dieren, wordt de naald geplaatst in de IVC en vervolgens verwijderd, zonder toepassing van de huidige.
  10. De laparotomie site is gesloten in een twee-lagen mode. Ons laboratorium maakt gebruik van 5-0 Vicryl, een synthetisch hechtdraad, in een doorlopend patroon af te sluiten van de buikwand. Adhesive huidlijm wordt gebruikt om de huid te sluiten. Er zijn geen externe hechtingen voor verwijdering.
  11. Muizen worden dan teruggevonden in een individuele muizen kooi, op de voet post-operatief waargenomen (45 minuten tot 2 uur) onder een warmtelamp (min. afstand 24 centimeter uit de buurt van kooi), keerde daarna terug naar hun oorspronkelijke woningen. Pijnstillers en anti-inflammatoire middelen kunnen worden gebruikt als het niet interfereert met studie doelstelling. Wetenschappelijke redenen om pijnstillers te weigeren, veterinaire en ICUCA goedkeuring nodig zijn. Ons laboratorium heeft uitgewezen dat Buprenorfine ,0.05-0 0,1 mg / kg SQ is een uitstekende pre-en post-operatieve analgeticum voor muizen. Bovendien kan Lidocaïne op 4mg/kg (0,4 ml / kg van een 1% oplossing) worden toegediend in de incisie site wanneer systemische analgetica kan experimentele resultaten verwarren.
  12. We meestal niet ervaren post-operatieve schadelijke effecten als gevolg van DVT. Kan echter negatieve post-operatieve effecten zijn spontane narcose dood, chirurgische bloedverlies, en gedeeltelijke parese als gevolg van zenuw trauma. Dieren die zijn traag om te herstellen kunnen worden ingevoerd nutria gel of vochtige chow op de vloer van de kooi om het dier terugwinning te vergemakkelijken. Dieren met verbreken post-operatieve complicaties op humane wijze worden gedood.
  13. Op de toegewezen tijdstip, is euthanasie humaan uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen uiteengezet door de American Veterinary Medical Association richtsnoeren inzake Euthanasie voor knaagdieren in te stellen.

3. Representatieve resultaten

Het EIM is een model dat trombus vormen in de aanwezigheid van continue bloedstroom. De volgende cijfers laten zien parameters onderzocht in deze roman model.

Figuur 1
Figuur 1 definesthe anatomische gebied waar een 25G roestvrij staalnaald, bevestigd aan een verzilverd koperdraad (KY-30-1-GRN, Electrospec, Dover, New Jersey) is geplaatst. Merk op dat een lymfatische node is vrijwel aanwezig is en helpt als een mijlpaal op zoek naar de caudale IVC.

Figuur 2
Figuur 2: trombus gewicht 2 dagen na EIM in verschillende stammen. Zoals verwacht, trombus gewicht was lager in de PAI-1 KO muizen en groter in hypercoagulatie Delta CT muizen (^ CT).

Figuur 3
Figuur 3: Oplosbaar P-selectine, een maker voor diepe veneuze trombose, werd gemeten in verschillende stammen. De laagste niveaus werden gevonden in PAI-1 KO muizen terwijl de hoogste niveaus werden gevonden in hypercoagulatie delta CT muizen.

Figuur 4
Figuur 4 Correlatie tussen trombus gewicht en oplosbaar P-selectine werd gevonden in verschillende stammen. Van de nota, in de groep die de kortere trombus grootte gegenereerd, de oplosbare P-selectine werd aangetoond was de laagste (PAI-1 KO muizen). In de groep die de grootste trombus grootte gegenereerd, de oplosbare P-selectine ontdekt was het hoogst (hypercoagulatie delta CT).

Figuur 5
Figuur 5: Met het oog op de aanwezigheid van de bloedstroom te tonen, echografie werd uitgevoerd bij muizen ondergaan EIM. Figuur 5 toont de echografie uitgevoerd in een muis 2 dagen na EIM. Dan is de monster was oogst. Let op de dat de trombus vorm trombusvorming suggereren in aanwezigheid van stroom

Discussion

De muis is een uitstekend research tool voor in vivo experimenten. Daarom is de ontwikkeling van muismodellen die nauw nabootsen ziekten of pathologische omstandigheden noodzakelijk zijn. Meerdere veneuze trombose muismodellen zijn gebruikt om DVT onderzoek, waaronder: fotochemische (2), stasis (3-4) en mechanische trauma (5-6). Echter, geen van deze modellen maken gebruik van een intern endotheel stimulans om een ​​thrombus in de aanwezigheid van continue bloedstroom te genereren. Het EIM, met behulp van elektrolytische stimulans binnen de IVC, bevordert de veneuze trombogenese door endotheel activatie in de aanwezigheid van de bloedstroom (1). Het is technisch eenvoudig, gemakkelijk reproduceerbaar en heeft een hoog overlevingspercentage (99%). Ondanks het feit dat een elektrische stroom wordt gebruikt om de elektrolyse te maken, wordt warmte niet gegenereerd (1). Het EIM-model simuleert nauw klinische DVT, en dus dient als een waardevol instrument voor het bestuderen van de intrinsieke mechanismen van trombusvorming en resolutie. Het EIM-model is ook nuttig voor de vooruitgang van de nieuwe therapeutische aanpak voor de bestrijding trombose ziekte.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Ondersteund door NIH 1P01HL089407-01A1 (Lawrence, PI), Animal Core A, NIH een K01 HL080962-01A2 (Myers, PI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen ABCD1234

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diaz, J. A., Hawley, A. E., Alvarado, C. M. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model. Thromb Haemost. 104, 366-375 (2010).
  2. Eitzman, D. T., Westrick, R. J., Nabel, E. G. Plasminogen activator inhibitor-1 and vitronectin promote vascular thrombosis in mice. Blood. 95, 577-580 (2000).
  3. Myers, D., Farris, D., Hawley, A. Selectins influence thrombosis in a mouse model of experimental deep venous thrombosis. J Surg Res. 108, 212-221 (2002).
  4. Myers, D. D., Hawley, A. E., Farris, D. M. P-selectin and leukocyte microparticles are associated with venous thrombogenesis. J Vasc Surg. 38, 1075-1089 (2003).
  5. Pierangeli, S. S., Barker, J. H., Stikovac, D. Effect of human IgG antiphospholipid antibodies on an in vivo thrombosis model in mice. Thromb Haemost. 71, 670-674 (1994).
  6. Pierangeli, S. S., Liu, X. W., Barker, J. H. Induction of thrombosis in a mouse model by IgG, IgM and IgA immunoglobulins from patients with the antiphospholipid syndrome. Thromb Haemost. 74, 1361-1367 (1995).
Elektrolytische Inferior Vena Cava Model (EIM) van veneuze trombose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Diaz, J. A., Wrobleski, S. K., Hawley, A. E., Lucchesi, B. R., Wakefield, T. W., Myers, Jr., D. D. Electrolytic Inferior Vena Cava Model (EIM) of Venous Thrombosis. J. Vis. Exp. (53), e2737, doi:10.3791/2737 (2011).More

Diaz, J. A., Wrobleski, S. K., Hawley, A. E., Lucchesi, B. R., Wakefield, T. W., Myers, Jr., D. D. Electrolytic Inferior Vena Cava Model (EIM) of Venous Thrombosis. J. Vis. Exp. (53), e2737, doi:10.3791/2737 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter