מדידה של לכידות צבירה ידי Tensiometry Surface רקמות

Summary

אנו מתארים שיטה למדידת אנרגיה מחייב, כפי שבא לידי ביטוי מתח הפנים רקמות, בין תאים בתוך הרקמה, כמו אגרגטים 3D. הבדלים מתח הפנים רקמות הוכחו לתאם עם הפולשנות של ריאות, שרירים, גידולים במוח, הם הגורמים הבסיסיים של כינון יחסים מרחביים בין סוגי תאים שונים.

Abstract

מדידה קפדנית של אנרגיית אינטר ניתן לבצע רק באמצעות שיטות מעוגנת בעקרונות תרמודינמיים של מערכות בשיווי משקל. פיתחנו משטח רקמה tensiometry (TST) במיוחד כדי למדוד את האנרגיה משטח ללא אינטראקציה בין תאים. המושגים הבסיסיים biophysical TST תוארו בעבר ^1,2 פרט. השיטה מבוססת על התצפית כי תאי מלוכדת הדדית, אם נשמרת רועד תרבות, באופן ספונטני להרכיב לתוך אשכולות. במשך הזמן, אשכולות אלו עגול עד טופס התחומים. התנהגות זו עיגול למעלה מחקה את התנהגות המאפיינת מערכות נוזלי. אנרגיית אינטר נמדדת על ידי דחיסת אגרגטים כדורית בין לוחות מקבילים tensiometer אישית מעוצבת משטח רקמה. משוואה מתמטית אותה משמש כדי למדוד את מתח הפנים של טיפת נוזל המשמש למדידת מתח הפנים של רקמות כמו אגרגטים 3D כדורית. המקבילה הסלולרית של מתח פני הנוזל הוא אנרגיית אינטר, או באופן כללי יותר, cohesivity רקמות. מחקרים קודמים מהמעבדה שלנו הראו כי פני השטח רקמות מתח (1) מנבא כיצד שתי קבוצות של תאים עובריים יהיה אינטראקציה זה עם זה ^1-5, (2) יכול מאוד להשפיע על היכולת של רקמות לתקשר עם biomaterials ^6, (3) יכול לשנות לא רק באמצעות מניפולציה ישירה של לכידות cadherin מבוססי אינטר ^7, אלא גם על ידי מניפולציה של מולקולות ECM מפתח כגון FN ^8-11 ו 4) בקורלציה עם פוטנציאל פולשני של סרטן הריאות ^12, fibrosarcoma ^{13, 14} ו - גידול במוח הגידול בערמונית שורות תאים ^15. במאמר זה נתאר את מנגנון בפירוט את הצעדים הנדרשים כדי ליצור spheroids, כדי לטעון את spheroids החדרה tensiometer, ליזום דחיסה המצרפי, לנתח ולאמת את פני השטח רקמות מדידות המתח שנוצר.

Protocol

1. הכנה מצטבר עבור מדידה של מתח הפנים רקמות.

עבור תאים חסיד, spheroids יכול להיווצר באמצעות אחת השיטה טיפה תלויה או על ידי יצירת דף קוהרנטית של תאים כי אז יכול להיות חתך לתוך שברי 1 מ"מ.

היווצרות צבירה בשיטת ירידה תלוי:

1. הקרוב ומחוברות בתרביות תאים חסיד צריך להיות מבוגר כדי מפגש 90%, monolayers ואז יש לשטוף פעמיים עם PBS. לאחר ניקוז טוב, להוסיף 2 MLS (עבור 100 צלחות מ"מ) של 0.05% טריפסין-1 mM EDTA, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד תאים לנתק. עצור trypsinization ידי הוספת 2 MLS של המדיום להשלים בעדינות להשתמש פיפטה 5 מ"ל ל triturate את התערובת עד התאים בתרחיף. העברת התאים צינור חרוטי 15 מ"ל.
2. הוסף 40 μl של פתרון DNAse 10 מ"ג / מ"ל ​​מניות דגירה במשך 5 דקות ב RT. וורטקס בקצרה צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות.
3. בטל supernatant ולשטוף עם גלולה 1 מ"ל להשלים בינוני רקמה תרבות. חזור, ואז התאים resuspend ב 2 MLS של המדיום רקמה שלמה תרבות.
4. ספירת התאים באמצעות hemacytometer, או נגד תא אוטומטיות ולהתאים הריכוז 2.5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל.
5. הסר את מכסה צלחת 60 מ"מ רקמת תרבות מקום 5 MLS של PBS בתחתית הצלחת. זה ישמש חדר הידרציה.
6. הפוך את המכסה להשתמש פיפטה 20 μl להפקיד 10 טיפות μl על החלק התחתון של המכסה. ודא כי טיפות ממוקמים מספיק מזה כדי לא לגעת. אפשר במקום לפחות 20 טיפות לכל מנה.
7. הפוך את המכסה על חדר-PBS מלא התחתונה לדגור על 37 ° CO 5 / _2% / 95% לחות, לעקוב אחר טיפות יומי לדגור עד או יריעות התא או אגרגטים יצרו.
8. לאחר בצורת יריעות, הם יכולים להיות מועברים מסביב לתחתית הכוס שייקר צלוחיות המכילות 3 של ה-MLS בינוני מלא מודגרות באמבט מים רועד ב 37 ° C ו 5% CO ₂ עד טופס spheroids.

היווצרות צבירה בשיטת גיליון התא:

9. המתלים תא יחיד מוכנים כפי שתואר לעיל, אך ריכוז מותאם 1x10 ⁶ תאים / מ"ל.
10. העברת 3 מ"ל של השעיה התא עד 10 מסביב לתחתית צלוחיות מ"ל (Belco, Vineland, NJ).
11. דגירה צלוחיות באמבט מים gyratory / שייקר (ניו ברונסוויק מדעי, אדיסון, ניו ג'רזי) בשעה 37 ° C, 5% CO ₂ עבור 4H בסל"ד עד 120 תאים להתאושש trypsinization.
12. העברת התאים צינור עגול תחתית זכוכית צנטריפוגה צנטריפוגה ב X 200 גרם לתוך גלולה דק. דגירה של 24 שעות אחר עד לקבלת גיליון קוהרנטית.
13. מערבולת בעדינות את הצינור התרבות כדי לסלק את הגיליון ושופכים את תוכנו של הצינור אל תוך התרבות קטן, רקמה סטרילית צלחת זכוכית תרבות.
14. השתמש אזמלים מיקרו לחתוך את גיליונות לרסיסים בגדלים שונים.
15. דגירה שברי ב 37 ° C על waterbath gyratory שייקר בסל"ד 120 לפי 5% CO ₂ על 2 עד 3 ימים או עד שהם הופכים כדורית.

2. מדידה של מתח הפנים המצרפי

1. משטח רקמה tensiometer. המכשיר מוצג תאנים. 1 ו -2. התא דחיסה (איור 3) מורכב משני חדרים. החדר החיצוני (OC) מחוברת משאבה 37 ° C במחזור המים, ומשמש לווסת את הטמפרטורה של החדר הפנימי (IC). החדרים בנויים Delrin הסתובבו ומכילים חלונות קוורץ להדמיה של המצרף. נמוך יותר (בלוס אנג'לס) הרכבה ברגים לתוך הבסיס של החדר הפנימי והוא משמש 1) עמדת המצרפי בחדר הפנימי; 2) חותם את החלק התחתון של החדר הפנימי: 3) להעלות את המצרפי ליזום דחיסה; ו (4 ) לשלוט על המרחק בין לוחות מקבילים ולכן דחיסה של המצרף. הליבה המרכזית (CC) האסיפה היא מתכווננת. קצה של הליבה המרכזית (הדום) מורכב חלקה טפלון משמש הצלחת דחיסה נמוך (LCP). צלחת דחיסה העליון (UCP) הוא גליל טפלון 15mm ארוך התלוי מהזרוע איזון (B) על ידי חוט להבה יישר ניקל כרום (NCW) *. במהלך ניסוי, במצטבר תא (A) ממוקם על הצלחת התחתונה וגדל עד שהוא קשר את הצלחת העליונה. צלחת העליון מחובר בזרוע איזון (B). דחיסה של מצרף גורמת תזוזה של היד איזון. האיזון הוא כאהן / Ventron מודל 2000 electrobalance הקלטה, הפועלת על עיקרון האיזון null. נקודת המשען של הזרוע האיזון יש עוגן בתוך שדה מגנטי קבוע. כאשר מאזן פועל, זה ללא הרף מודולציה עובר זרם דרך הרכבה האלקטרומגנטי, אשר בתורו שומר על איזון זרוע במצב אופקי. כאשר אובייקט הוא מושעה מהזרוע איזון, מתח, אשר חל איזון כדי לשמור על שלובי horizoעמדת ntal, הוא יחסי לשקול של האובייקט. מתח זה מודד את כוח דחיסה חיצוני להחיל במצטבר. הצורה של צבירה מנוטר על ידי תצפית ויזואלית באמצעות stereoscope 25 x SMZ10A Nikon מצמידים את המחשב מצויד grabber מסגרת. כדי למזער הידבקות של אגרגטים התא צלחות דחיסה, הן הצלחות דחיסה תחתון ועליון היו מצופים פולי (2-hydroxyethylmethacrylate) {פולי (המה)}, חומר פולימרי אשר התאים אינם דבקים ^16.
   * חוט היא להבה יישר בתלייה באורך 15-inch של חוט מדוכן תשובה ו clamping קליפ קלסר קטן עד הסוף. מבער בונזן מנוהלת מלמעלה למטה, את אורך החוט עד חוט אדום זוהר. החוט יישר לאחר מכן ניתן לחתוך את אורכי המתאים. וו קטן נוצר על ידי כיפוף חוט כ ¼ סנטימטר מקצה באמצעות שני סכיני גילוח. בקצה השני מוכנס לתוך חבית אז הצלחת דחיסה נמוך יותר.
2. צבירה דחיסה.
   1. החדר הפנימי מלא מראש חימם בינוני CO ₂ עצמאית רקמה תרבות (Gibco / BRL, ניו יורק).
   2. מצרפים החל בגודל כ 200-300 μ ממוקמים על הצלחת דחיסה נמוך יותר (איור 4 א). מצרפי נטענים על ידי aspirating צבירה במדיום רקמה תרבות בחצי הדרך קצה פיפטה פסטר מצוידת בנורה סיליקון, העברת פיפטה לחדר פנימי, ומיקום קצה פיפטה מעל LCP. המצרפי היא אז גורשו על ידי בעדינות בעדינות לוחצת את הנורה על LCP. לחלופין, במצטבר מותר ליפול על ידי כוח הכבידה על LCP.
   3. צלחת דחיסה העליון (UCP) ממוקמת מעל במצטבר ואיפשר להתיישב, להקים טרום דחיסה בסיסית לכאורה משקל UCP.
   4. LCP הוא העלה אז עד המצרפי דחוס נגד UCP (איור 4 ב). התאמת גובה של הליבה הפנימית של המנגנון התחתון ישלוט דרגות שונות של דחיסה. דחיסה מנוטר על ידי תצפית דרך מיקרוסקופ לנתח מצויד במצלמת וידאו CCD.
   5. תמונות צבירה נלכדים, דיגיטציה, ונותחו באמצעות ImageJ. לכאורה לשנות UCP משקל נרשם ברציפות על מקליט רצועה תרשים, ההישג של שיווי משקל הצורה להיות מסומן על ידי off-פילוס התפוקה מתח את האיזון של כהן. המצרפי כל נתון 2 דרגות שונות של דחיסה.
3. חישוב מתח הפנים המצרפי.
   בשיווי משקל, צורה, cohesivity של המצרפי של תאים דחוסים בין לוחות מקבילים אשר אין לדבוק ניתן לקבל משוואה יאנג-Laplace (איור 5), שם היא σ cohesivity, F הוא הכוח הפועל לדחוס את המצרפי , πr ₃ ² הוא אזור של פני השטח של הצבירה שעליו מופעל כוח F, ו-R ₂ ו R ₃ הן, בהתאמה, רדיוס של קו המשווה של מצרף דחוס הרדיוס של קשת הגדרת פרופיל פני השטח שלו נורמלי על דחיסת צלחות הארכת ביניהם (איור 6). מדידת כוח דחיסה הגיאומטריה ועל כוח ושיווי משקל צורה ויישום מדידות אלה למשוואה יאנג-Laplace מייצר ערכים מספריים של מתח רקמות לכאורה על פני השטח. בהגיעם שיווי משקל וחישוב σ _1, אגרגטים הם decompressed ואיפשר גישה שיווי משקל השני σ ₂ מחושב כמתואר לעיל.
4. אישור נזילות המצרפי.
   מתח הפנים מחושב של צבירה נוזלי, כאשר נתון לשני עיסויים שונים יישאר קבוע. ב אגרגטים כזה יחס σ ₂ / σ ₁ יהיה שווה ל 1 ו יפחת היחס של הכוח ליישם דחיסה כל רצופים (F ₂ / F _1). לעומת זאת, מתח הפנים מחושב המצרפי של אלסטית יצייתו חוק הוק ולהגדיל את יחסי הכוח ליישם. עבור אגרגטים אלסטי יחס σ ₂ / σ ₁ לא יהיה שווה ל 1 אבל יהיה במקום גישת היחס בין F ₂ / F _1. מתח הפנים של אגרגטים נוזלי יהיה גם ללא תלות בגודל ^2,17 המצרפי. מדידות היחיד שבו מתח פנים הוא עצמאי של כוח ליישם וגודל משמשים כדי לחשב σ הממוצע עבור כל קו התא.

3. נציג התוצאות:

להלן טבלה של תוצאות TST אופייני אגרגטים של הערמונית fibroblasts חולדה (RPF) ו עכברוש תאים הערמונית שריר חלק (RPSMC). כפי שניתן לראות באיור. 7 אגרגטים של תאים RPF יש מתח הפנים של 22.8 ± 1.1 dynes / ס"מ. יתר על כן, המתח מתכוון פני הערכים שנמדדו לאחר דחיסה 1 לאחר דחיסה 2 היו הזיהוי סטטיסטיתiCal בהשוואה ידי מבחן t מזווג. השווינו גם את היחס של σ ₂ / σ ₁ ו-F ₂ / F ₁ על מנת להבטיח כי אגרגטים אלה לא לציית לחוק של הוק, כפי שהם היו, אם הם התנהגו כמו מוצקים אלסטיים. כפי שמודגם בלוח 1, יחס של σ ₂ / σ ₁ אכן הגישה 1.0. יתר על כן, היחס בין F ₂ / F ₁ היה גבוה משמעותית מאשר σ ₂ / σ ₁ (לזווג מבחן t, P <0.05), נוסף המאשר כי אגרגטים אלה אינם מקיימים את חוק הוק ולמעשה מתנהגים כמו נוזלים. ב RPSMCs בניגוד ציית חוק הוק. כפי שניתן לראות בלוח 1, יחס של σ ₂ / σ ₁ הוא גדול משמעותית מ 1 ולא היה שונה סטטיסטית מזו של F ₂ / F _1. כדי להמשיך להפגין נוזל דמוי התנהגות, בחנו את הקשר בין מתח הפנים (σ) ונפח מצטבר. כפי שניתן לראות באיור. 8, נפח היא עצמאית של סיגמא עבור תאים RPF (קו רגרסיה אדום, r ² = 0.002), בעוד נראה כי כמה התלות של סיגמא על היקף עבור RPSMCs (קו רגרסיה כחול, r ² = 0.146). נתונים אלה מאשרים כי עוד אגרגטים RPF להתנהג באופן דמוי נוזל, בעוד שאלו של RPSMCs להופיע להתנהג יותר כמו מוצק אלסטי. רק mesurements אלה המתקבלים אגרגטים מתנהג כמו נוזלים יהיה להשתמש כדי לחשב מתח הפנים.

באיור 1. סקירת tensiometer את פני השטח רקמות.

איור 2. תצוגה מפורטת יותר של החדר tensiometer (פאנל מימין).

3. תרשים סכמטי נוף של החדר tensiometer.

איור 4. תמונות של (B) אגרגטים דחוס (א) ו דחוס.

איור 5. משוואת לפלס.

איור 6. דיאגרמה של אגל נוזל דחוס בין שני לוחות מקבילים שהיא שומרת גרוע, בשיווי משקל צורה. R ₁ ו R ₂ הם רדיוסים two העיקרי של עקמומיות, בקו המשווה של אגל במטוס דרך ציר הסימטריה, בהתאמה. R ₃ הוא הרדיוס של השטח החוזר של אגל של מגע עם צלחת או דחיסה. H הוא המרחק בין הלוחות דחיסה העליון והתחתון. X הוא צד אחד של משולש ישר זווית עם R ₂ היתר הרחבת נקודת המגע בין פני השטח של אגל או צלחת דחיסה.

	σ 1 (dynes / ס"מ ± SEM)	σ 2 (dynes / ס"מ ± SEM)	Pσ 1 vs σ 2	σ 1,2 (dynes / ס"מ ± SEM)	σ 2 / σ 1	F 2 / F 1	Pσ 2 / σ 1 ו-F 2 נ 1
RPF	22.6 ± 1.7	22.9 ± 1.4	> 0.05 *	22.8 ± 1.1	1.04 ± 0.04	1.47 ± 0.06	<0.05
RPSMC	15.0 ± 2.8	23.0 ± 3.2	0.039	NA	1.9 ± 0.3	1.6 ± 0.1	0.16 *

איור 7. המדידות TST ואישור נזילות המצרפי אגרגטים של הערמונית fibroblasts חולדה ותאי שריר חלק.

איור 8. הקשר בין סיגמא ונפח עבור מצרפי של RPF (קו אדום) RPSMCs (הקו הכחול).

Discussion

מדידת הלכידות המצרפי על ידי TST היא פשוטה יחסית. יש, עם זאת, שלבים עיקריים שיש שולט על מנת להפיק נתונים TST שמיש; 1) אגרגטים חייב להיות "בריא". זה יכול להיות נשלט על ידי הקפדה היווצרות המצרפי מתחילה בתאים בנקודת המפגש אופטימלי לפני ניתוק. גודל זמן מצטבר ובתרבות חייב גם להיות מבוקרים כדי למזער את הפיתוח של ליבת נמקי בתוך המצרפי; 2) פרמטר נוסף שיכול להשפיע על מדידות TST היא מידת הדבקות של מצרף את צלחות דחיסה העליון או התחתון. לפיכך, ריכוז אופטימלי של פולי-המה בעבר המעיל צלחות צריכה להיקבע באופן אמפירי לכל סוג של המצרף; 3) למרות שזה עדיף כי דחיסה מראש אגרגטים צריכים להיות כדורית ככל האפשר, אין זה הכרחי. חלק אגרגטים, במיוחד אלה מוחזקים יחד בחולשה, נוטים שלא ליצור כדורים מושלמים. ההסבר לכך הוא שכדי התאים לחלוטין עגול למעלה צריך להוציא אנרגיה על ידי העברת מחדש וסידור. אם כמות האנרגיה הנדרשת כדי סיבוב כלפי מעלה לכדור עולה על צמצום האנרגיה להיות כדורית, אגרגטים יהיה נוטים דוכן בבית צורה כדורית משנה כמה. מניסיוננו, כגון אגרגטים על להיות דחוס, להתנגד בכוח דחיסה עד כדי כך את הצדדים של הטופס המצרפי למחצה במעגלים, בדיוק כפי שהם היו עושים אם החל כדור מושלם; 4) חשוב גם כי דחיסה צלחות מקבילים אחד אחר. מטרה זו מושגת בצורה הטובה ביותר להבטיח כי חוט ניקל כרום הוא ישר כי המכשיר הוא ברמה ומודדים. אם אמצעים אלה הם דבק, משטח tensiometry רקמה היא פשוטה יחסית, ניתן להפיק מידע שימושי מאוד על תכונות מכניות של רקמות של הגורמים המולקולריים שבבסיס שלהם.

שיטות אחרות למדידת לכידות המצרפי קיימים, כמה זה מבטל את הצורך ציוד מיוחד כגון electrobalance כאהן. שיטה אחת כזו aspirates spheroid לתוך טפטפת בקוטר קטן בהרבה מזה של spheroid, עם לחץ יניקה מתמדת. המאפיינים viscoelastic של הרקמה הם להסיק וריאציה של המתח על ידי מדידת השינוי באורך של החומר התאי כפי שהוא זורם בתוך פיפטה ^18. אמנם שימושי, שיטה זו ייתכנו הגבלות, כמו טווח של מתחים השטח שבו הוא יכול להיות מיושם. אגרגטים חלש מאוד עלול להיהרס כפי שהם aspirated לתוך פיפטה, בעוד אגרגטים כי מוחזקים יחד חזק מאוד לא יכול להיות aspirated בכלל. דחיסה צלחת במקביל יש למדוד מתחים משטח נמוך כמו 0.33 ± 0.02 dynes / ס"מ האאקטודרם שכבת דג הזברה חיידק שטופלו E-cadherin morpholino ³ עד גבוה ככל 20.1 ± 0.5 dynes / ס"מ אגרגטים של איבר עוברי אפרוח ניצן והמזודרם ^2, הוכחת שלה השירות כללי על מגוון רחב של מערכות לכידות עובריים מספר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
water bath/shaker	New Brunswick Scientific
10 ml round-bottom flasks	Bellco Glass