Mätning av Aggregate sammanhållning genom vävnadsytan tensiometri

Summary

Vi beskriver en metod för att mäta bindningsenergi, expressible som vävnad ytspänning, mellan celler inom 3D vävnad-liknande aggregat. Skillnader i vävnaden ytspänning har visat sig korrelera med invasivitet av lung-, muskel, och hjärntumörer, och är grundläggande faktorer för upprättande av rumsliga relationer mellan olika celltyper.

Abstract

Rigorös mätning av intercellulära bindande energi kan endast göras med metoder som bottnar i termodynamiska principer i system vid jämvikt. Vi har utvecklat tensiometri vävnadsytan (TST) specifikt för att mäta ytan fria energi av interaktionen mellan celler. Det biofysiska begrepp som underbygger TST har tidigare beskrivits i detalj ^1,2. Metoden bygger på iakttagelsen att ömsesidigt sammanhängande celler, om upprätthålls i skakning kultur, spontant kommer att montera in kluster. Med tiden kommer dessa kluster runda upp för att bilda sfärer. Denna avrundning uppåt beteende härmar beteendet karaktäristiskt för flytande system. Intercellulära bindningsenergi mäts genom att komprimera sfäriska aggregat mellan parallella plattorna i en specialdesignad vävnadsytan tensiometer. Samma matematisk ekvation som används för att mäta ytspänningen i en flytande droppe används för att mäta ytspänning 3D vävnad-liknande sfäriska aggregat. Det cellulära motsvarande flytande ytspänningen är intercellulära bindande energi, eller mer allmänt, vävnad cohesivity. Tidigare studier från vårt laboratorium har visat att vävnad ytspänning (1) förutsäger hur två grupper av embryonala celler kommer att interagera med varandra ^1-5, (2) kan starkt påverka förmågan av vävnader att interagera med biomaterial ^6, (3) kan ändras inte bara genom direkt manipulation av cadherin-baserade intercellulära sammanhållning ^7, men också genom manipulation av viktiga ECM-molekyler såsom FN ^8-11 och 4) korrelerar med invasiv potential lungcancer ^12, fibrosarkom ^13, hjärntumör ¹⁴ och prostata tumör cellinjer ^15. I denna artikel kommer vi att beskriva apparaten, detalj de åtgärder som krävs för att generera spheroids, för att ladda spheroids i tensiometer kammaren, att inleda samlade kompression, och att analysera och validera vävnaden ytspänningen genereras mätningar.

Protocol

1. Aggregate förberedelse för mätning av vävnad ytspänning.

För anhängare celler kan spheroids bildas med hjälp av antingen den hängande släpp-metoden eller genom att generera en sammanhängande blad av celler som sedan kan skäras i 1 mm fragment.

Samlade bildandet av droppe metoden:

1. Nära-sammanflytande anhängare cellkulturer bör odlas till 90% sammanflödet bör varefter monolager sköljas två gånger med PBS. Efter dränering väl, tillsätt 2 MLS (för 100 mm plattor) på 0,05% trypsin-1 mM EDTA, och inkubera vid 37 ° C tills cellerna lossnar. Sluta trypsinization genom att tillsätta 2 ml av kompletta medium och försiktigt använda en 5 ml-pipetten på mal sönder blandningen tills cellerna är i suspension. Överför celler till en 15 ml koniska rör.
2. Tillsätt 40 l av en 10 mg / ml DNAse stamlösning och inkubera i 5 minuter i RT. Vortex kort och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter.
3. Kassera supernatanten och tvätta pellets med 1 ml klar vävnadskultur medium. Upprepa sedan resuspendera celler i 2 ml av kompletta vävnadskultur medium.
4. Räkna celler med hjälp av en hemacytometer eller automatiserade celltalsräknare och justera koncentrationen till 2,5 x 10 ⁶ celler / ml.
5. Ta bort locket från en 60 mm vävnadsodling skål och placera 5 ml av PBS i botten på skålen. Detta kommer att fungera som en hydration kammare.
6. Vänd locket och använder en 20 l pipett för att sätta in 10 l droppar på undersidan av locket. Se till att dropparna är placerade tillräckligt isär så att inte röra. Det är möjligt att placera minst 20 droppar per maträtt.
7. Vänd locket på PBS fylld botten kammaren och inkubera vid 37 ° C / 5% CO ₂ / 95% luftfuktighet, övervaka droppar dagligen och inkubera tills antingen cell ark eller aggregat har bildats.
8. När ark form, kan de överföras till rundbottnad glas shaker kolvar innehållande 3 ml av kompletta medium och inkuberas i en skakande vattenbad vid 37 ° C och 5% CO ₂ tills spheroids form.

Samlade bildandet av cellen ark metoden:

9. Enstaka cellsuspensioner är beredda enligt ovan, men koncentrationen är anpassad till 1x10 ⁶ celler / ml.
10. Överför 3 ml av cellsuspensionen till 10 ml rundbottnad kolvar (Belco, Vineland, NJ).
11. Inkubera kolvarna i en spindelkross vattenbad / shaker (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) vid 37 ° C, 5% CO ₂ i 4h vid 120 rpm tills cellerna återhämta sig från trypsinization.
12. Överför celler till ett glas rundbottnad centrifugrör och centrifugera vid 200 X g till en tunn kaka. Inkubera i ytterligare 24 h tills en sammanhängande blad former.
13. Vagga försiktigt kultur röret för att lossa plåten och häll innehållet i kulturen röret i en liten, sterilt glas vävnadskultur maträtt.
14. Använd mikro skalpeller att skära bladen i fragment av olika storlekar.
15. Inkubera fragment vid 37 ° C på spindelkrossar vattenbad shaker vid 120 rpm under 5% CO ₂ för 2 till 3 dagar eller tills de blir sfäriska.

2. Mätning av totala ytspänningen

1. Vävnadsytan tensiometer. Apparaten visas i figurerna. 1 och 2. Kompressionen cell (Fig. 3) består av två kammare. Den yttre kammaren (OC) är ansluten till ett 37 ° C cirkulerande vatten pump, och tjänar till att reglera temperaturen i den inre kammaren (IC). Kamrarna är tillverkade av helt slipat Delrin och innehåller kvarts fönster för visualisering av den samlade. Den lägre montering (LA) skruvar in i botten av den inre kammaren och används för att 1) ​​placera samlade i den inre kammaren, 2) täta botten av inre kammaren, 3) höja den sammanlagda att initiera kompression, och (4 ) kontrollera avståndet mellan de parallella plattorna och därmed komprimering av den totala. Den centrala kärnan (CC) i församlingen är justerbar. Spetsen på den centrala kärnan (sockeln) består av slät teflon och fungerar som den lägre kompression plattan (LCP). Den övre pressplattan (UCP) är en teflon cylinder 15mm långa som hänger från balansräkningen armen (B) genom att en flamma-uträtat nickel-krom tråd (NCW) *. Under ett experiment, är cellen aggregat (A) placerad på den nedre plåten och höjde tills den kommer i kontakt den övre plattan. Den övre plattan är ansluten till balansen armen (B). Komprimering av den sammanlagda orsakerna förskjutning av balansen armen. Balansen är en Cahn / Ventron modell 2000 inspelning electrobalance, som driver på den null balansen principen. Stödpunkten av balansen armen har en armatur i ett permanent magnetfält. När balansen är i drift, modulerar den kontinuerligt den aktuella passerar genom elektromagnetiska församling, som i sin tur upprätthåller balansen armen i horisontellt läge. När ett objekt är avstängd från balansen armen, spänningen, som balansen gäller att hålla armen i horizontal position är proportionell mot objektets väger. Denna spänning mäter den yttre tryckkraft appliceras på aggregat. Den sammanlagda s form är övervakas av visuell observation genom en 25 x Nikon SMZ10A stereoskopet kopplad till en dator utrustad med en ram grabber. För att minimera vidhäftning cellaggregat till kompression plattor, både den nedre och övre komprimering plåtar täckta med poly (2-hydroxyethylmethacrylate) {poly (HEMA)}, en polymera material som cellerna inte håller sig ^16.
   * Tråden är flam-rätas genom att hänga en 15-tums längd av tråd från en retort står och fastspänning en liten pärm klipp till slutet. En Bunsenbrännare är sedan springa upp och ner längden av kabeln tills tråden glöder rött. Den rätade tråden kan sedan skära in i lämpliga längder. En liten krok bildas genom att böja tråd ungefär ¼ av en tum från slutet med två rakblad. Den andra änden är då in i cylindern på lägre kompression plattan.
2. Aggregate komprimering.
   1. Den inre kammaren är fylld med förvärmda CO _2-oberoende vävnad odlingssubstrat (Gibco / BRL, NY).
   2. Ballast varierar i storlek från ca 200-300 μ är placerade på lägre kompression plattan (Fig. 4A). Ballast läses in som aspirera ett aggregat i vävnadskultur medelstora halvvägs upp som toppen av ett pasteurpipett försedd med en silikon glödlampa, överföra pipetten för att den inre kammaren, och placera spetsen på pipetten ovanför LCP. Den sammanlagda är sedan försiktigt utvisas på LCP genom att försiktigt klämma ut glödlampan. Alternativt är den sammanlagda tillåts falla av tyngdkraften på LCP.
   3. Den övre pressplattan (UCP) är placerad över den samlade och tillåtas att bosätta sig, om inrättande av en pre-komprimering uppenbart baseline UCP vikt.
   4. LCP är sedan upp till den sammanlagda komprimeras mot UCP (Fig. 4B). Justera höjden på den inre kärnan av den nedre apparaten kommer att kontrollera olika grader av komprimering. Komprimering övervakas av observation genom ett dissekera mikroskop utrustad med en CCD-videokamera.
   5. Aggregate bilderna har tagits digitaliseras, och analyseras med hjälp ImageJ. Skenbar UCP viktförändring kontinuerligt registreras på en remsskrivare, uppnående av formen jämvikt som betecknas med utjämning-off av Cahn balansen är spänningsutgång. Varje aggregat är föremål för två olika grader av komprimering.
3. Beräkning av samlade ytspänning.
   I form jämvikt kan cohesivity om sammanlagt celler komprimerad mellan parallella plattor som den inte följer hämtas från Young-Laplace ekvation (bild 5), där σ är cohesivity är F den kraft som agerar för att komprimera den sammanlagda , πr ₃ ² är den del av ytan av den samlade på vilken kraft F utövas, och R ₂ och R ₃ är, respektive, den radie av ekvatorn i den komprimerade samlade och radien på en båge definiera dess ytprofil normala till att komprimera tallrikar och sträcker sig mellan dem (Fig. 6). Mätning av tryckkraft och geometri i kraft och form jämvikt och tillämpa dessa mätningar till Young-Laplace ekvation genererar numeriska värden av uppenbara vävnad ytspänning. Vid ankomsten till jämvikt och beräkning av σ _1, aggregat expanderas och tillåts att närma sig en andra jämvikt och σ ₂ beräknas enligt ovan.
4. Bekräftelse av samlade likviditet.
   Den beräknade Ytspänningen hos en vätska samlade, kommer när det utsätts för två olika komprimeringar förblir konstant. I ett sådant aggregat förhållandet mellan σ ₂ / σ ₁ kommer att vara lika med 1 och kommer att vara mindre än förhållandet mellan den kraft som anbringas på varje efterföljande kompression (F ₂ / F _1). Däremot kommer den beräknade ytspänningen i en elastisk sammanlagd lyda Hooke: s lag och ökar proportionellt mot den verkande kraften. För elastiska aggregat förhållandet mellan σ ₂ / σ ₁ kommer inte att vara lika med 1 utan i stället närma sig förhållandet mellan F ₂ / F _1. Ytspänningen hos flytande aggregat kommer också vara oberoende av den samlade storleken ^2,17. Endast mätningar där ytspänningen är oberoende av den verkande kraften och storlek används för att beräkna genomsnitt σ för varje cell linje.

3. Representativa resultat:

Nedan följer en tabell över typiska TST resultat för aggregat av fibroblaster råtta prostata (RPF) och råtta prostata smidig muskelceller (RPSMC). Som framgår av figur. 7 aggregat av RPF celler har en ytspänning på 22,8 ± 1,1 dynes / cm. Dessutom var genomsnittlig ytspänning uppmätta värdena efter kompression 1 och efter kompression 2 statistiskt identiCal jämfört med parade t-test. Vi jämförde också förhållandet mellan σ ₂ / σ ₁ och F ₂ / F ₁ för att säkerställa att dessa aggregat inte lydde Hooke: s lag, som de skulle om de betedde sig som elastiska partiklar. Som framgår av tabell 1, förhållandet mellan σ ₂ / σ _ett faktiskt förhållningssätt 1,0. Dessutom var förhållandet mellan F ₂ / F ₁ betydligt större än σ ₂ / σ ₁ (parad t-test, P <0,05), vilket ytterligare bekräftar att dessa aggregat inte lyder Hooke: s lag och i själva verket beter sig som vätskor. I motsats RPSMCs lydde Hooke lag. Som framgår av tabell 1, förhållandet mellan σ ₂ / σ ₁ är betydligt större än 1 och var inte statistiskt annorlunda än F ₂ / F _1. För att ytterligare påvisa vätska-liknande beteende, utforskade vi sambandet mellan ytspänningen (σ) och totala volym. Som framgår av figur. 8, volym oberoende av Sigma för RPF celler (röda regressionslinje, R ² = 0,002), medan det verkar vara en del beroende av Sigma på volym för RPSMCs (blå regressionslinje, R ² = 0,146). Dessa uppgifter bekräftar vidare att RPF aggregat beter sig i en vätska-liknande sätt, medan de RPSMCs verkar bete sig mer som elastiska partiklar. Endast de Måttuppgifter från aggregat beter sig som vätskor skulle användas för att beräkna ytspänningen.

Figur 1. Översikt över vävnadsytan tensiometer.

Figur 2. En mer detaljerad bild av tensiometer kammaren (högra panelen).

Figur 3. Schematisk bild av tensiometer kammaren.

Figur 4. Bilder av okomprimerad (A) och komprimerade (B) aggregat.

Figur 5. Laplaces ekvation.

Figur 6. Diagram av en vätska droppe komprimerad mellan två parallella plattor som den håller sig dåligt, i form jämvikt. R ₁ och R ₂ är de två primära krökningsradierna på droppen ekvator och i ett plan genom sin symmetriaxel, respektive. R ₃ är radien på droppen cirkulär området kontakt med antingen kompression platta. H är avståndet mellan övre och lägre kompression tallrikar. X är en sida av en rätvinklig triangel med hypotenusan R ₂ som sträcker sig till en kontaktpunkt mellan droppen yta och antingen kompression plattan.

	σ 1 (dynes / cm ± SEM)	σ 2 (dynes / cm ± SEM)	Pσ 1 vs σ 2	σ 1,2 (dynes / cm ± SEM)	σ 2 / σ 1	F 2 / F 1	Pσ 2 / σ 1 och F 2 F 1
RPF	22,6 ± 1,7	22,9 ± 1,4	> 0,05 *	22,8 ± 1,1	1,04 ± 0,04	1,47 ± 0,06	<0,05
RPSMC	15,0 ± 2,8	23,0 ± 3,2	0,039	NA	1,9 ± 0,3	1,6 ± 0,1	0,16 *

Figur 7. TST mätningar och bekräftelse på aggregerad likviditet för aggregat av fibroblaster råtta prostata och smidig muskelceller.

Figur 8. Förhållandet mellan Sigma och volym för aggregat av RPF (röd linje) och RPSMCs (blå linje).

Discussion

Mätning av totala sammanhållningen av TST är relativt enkelt. Det finns dock viktiga steg som måste bemästras för att skapa användbara TST uppgifter, 1) aggregat måste vara "frisk". Detta kan kontrolleras genom att sammanlagda bildningen börjar med celler som är optimalt sammanflödet före avskiljandet. Sammanlagda storlek och tid i kulturen måste också kontrolleras för att minimera utvecklingen av en nekrotisk kärna inom den sammanlagda, 2) En annan parameter som kan påverka TST mätningar är graden av vidhäftning av det sammanlagda till den övre eller lägre kompression plattor. Därför plattorna den optimala koncentrationen av poly-HEMA används för att belägga empiriskt måste bestämmas för varje typ av stenmaterial, 3) Även om det är bättre att pre-komprimering aggregat bör vara så sfäriska som möjligt, är det inte absolut nödvändigt. Vissa aggregat, särskilt de som hålls ihop svagt, tenderar att inte bilda perfekt sfärer. Förklaringen till detta är att för att helt runda upp celler måste förbruka energi genom att flytta och omfördela. Om mängden energi som krävs för att runda upp i en sfär än den energi minimering att bli sfäriska, kommer aggregat tenderar att stall på några sub-sfäriska form. Vår erfarenhet är att sådant aggregat när de blir komprimerad, motstå tryckkraft i en utsträckning som sidorna på aggregerad form semi-kretsar, precis som de skulle göra om efter en perfekt sfär, 4) Det är också viktigt att komprimering plattorna är parallella med en-annan. Detta sker bäst genom att säkerställa att nickel-krom tråd är rak och att instrumentet är nivån och lod. Om dessa åtgärder följs, är vävnadsytan tensiometri relativt enkelt och kan generera mycket användbar information om mekaniska egenskaper hos vävnader och av deras bakomliggande molekylära bestämningsfaktorer.

Andra metoder för att mäta sammanlagd sammanhållning finns några som eliminerar behovet av specialiserad utrustning såsom Cahn electrobalance. En sådan metod aspirat en sfäroid i en pipett med mycket mindre diameter än sfäroid, med ett konstant sug tryck. Den viskoelastiska egenskaperna hos vävnaden skall dras från det variationen av stammen genom att mäta förändringen i längden av cellulära material som flyter in i pipetten ^18. Även användbar, kan den här metoden har begränsningar vad gäller utbudet av ytan spänningar där den kan tillämpas. Mycket svag aggregat sannolikt skulle förstöras eftersom de är aspireras i pipetten, medan aggregat som hålls samman mycket starkt inte kan aspireras alls. Parallell tallrik komprimering har mätt yta spänningar så lågt som 0,33 ± 0,02 dynes / cm för zebrafisk groddar lager ektoderm behandlas med E-cadherin morpholino ³ till så högt som 20,1 ± 0,5 dynes / cm för aggregat av embryonala chick lem knopp mesoderm ^2, visar sitt allmänna verktyget över ett brett sammanhållning utbud för flera embryonala system.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
water bath/shaker	New Brunswick Scientific
10 ml round-bottom flasks	Bellco Glass