Summary
We beschrijven een methode voor het meten bindingsenergie, worden uitgedrukt als weefsel oppervlaktespanning, tussen de cellen in 3D weefsel-achtige aggregaten. Verschillen in weefsel oppervlaktespanning is aangetoond dat zij correleren met invasiviteit van de longen, de spieren, en hersentumoren, en zijn fundamentele determinanten van oprichting van ruimtelijke relaties tussen de verschillende celtypen.
Abstract
Strenge meting van intercellulaire bindingsenergie kan alleen gemaakt worden met behulp van methoden gebaseerd op thermodynamische principes in de systemen bij evenwicht. We hebben ontwikkeld weefseloppervlak tensiometry (TST) specifiek aan de oppervlakte vrije energie van de interactie tussen de cellen te meten. De biofysische concepten ten grondslag liggen aan TST zijn eerder in detail beschreven 1,2. De methode is gebaseerd op de observatie dat onderling samenhangende cellen, indien gehandhaafd in schudden cultuur, spontaan assembleren in clusters. Na verloop van tijd zullen deze clusters rond tot bollen vormen. Deze afronding-up gedrag imiteert het gedrag een kenmerk van vloeibaar-systemen. Intercellulaire binding energie wordt gemeten door het comprimeren van bolvormige aggregaten tussen parallelle platen in een speciaal ontworpen weefseloppervlak tensiometer. Dezelfde wiskundige vergelijking gebruikt om de oppervlaktespanning van een vloeistof druppel maatregel wordt gebruikt om de oppervlaktespanning van 3D weefsel-achtige bolvormige aggregaten te meten. De cellulaire equivalent van vloeibare oppervlaktespanning is intercellulaire bindingsenergie, of meer algemeen, weefsel cohesivity. Eerdere studies van ons laboratorium hebben aangetoond dat weefsel oppervlaktespanning (1) voorspelt hoe de twee groepen van embryonale cellen met elkaar 1-5, (2) kan een sterke invloed van het vermogen van weefsels om te interageren met biomaterialen 6, (3) kan worden veranderd, niet alleen door directe manipulatie van cadherine-based intercellulaire cohesie 7, maar ook door manipulatie van de belangrijkste ECM moleculen zoals FN 8-11 en 4) correleert met invasieve potentieel van longkanker 12, fibrosarcoom 13, hersentumor 14 en prostaat tumor cellijnen 15. In dit artikel beschrijven we het apparaat, detail de stappen die nodig zijn om sferoïden te genereren, om de sferoïden te laden in de tensiometer kamer, te aggregeren compressie gang te brengen en te analyseren en valideren van het weefsel oppervlak gegenereerde spanning metingen.
Protocol
1. Totale voorbereiding voor het meten van weefsel oppervlaktespanning.
Voor hechtende cellen, kan sferoïden worden gevormd door met behulp van de opknoping neerzetten of door het genereren van een coherente plaat van cellen die vervolgens kan worden gesneden in 1 mm fragmenten.
Totale formatie van de opknoping neerzetten:
- Near-samenvloeiende adherente celkweken moeten worden gekweekt tot 90% confluentie, dient waarna monolagen twee keer gespoeld met PBS. Na het aftappen goed, voeg 2 ml (voor 100 mm platen) van 0,05% trypsine-1 mM EDTA, en incubeer bij 37 ° C tot cellen los te maken. Stop trypsinisatie door toevoeging van 2 ml van compleet medium en voorzichtig gebruik van een 5 ml pipet op het mengsel vermaal tot de cellen in suspensie. Overdracht cellen om een 15 ml conische buis.
- Voeg 40 pi van een 10 mg / ml DNase voorraad-oplossing en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Vortex kort en centrifugeer op 200 xg gedurende 5 minuten.
- Gooi supernatans en was pellet met 1 ml volledige weefselkweek medium. Herhalen, dan resuspendeer cellen in 2 ml van volledige weefselkweek medium.
- Tel de cellen met behulp van een hemacytometer, of geautomatiseerde celgetalmeter en aan te passen concentratie 2,5 x 10 6 cellen / ml.
- Verwijder het deksel van een 60 mm weefselkweek schotel en plaats 5 ml van PBS op de bodem van de schotel. Deze zal fungeren als een hydratatie kamer.
- Keer de deksel en gebruik een 20 ul pipet tot 10 pl druppels op de bodem van het deksel storting. Zorg ervoor dat de druppels zo genoeg van elkaar geplaatst, dat niet aanraken. Het is mogelijk om plaats minstens 20 druppels per schotel.
- Omgekeerde het deksel op de PBS-gevulde onderste kamer en incubeer bij 37 ° C / 5% CO 2 / 95% luchtvochtigheid, toezicht op het dagelijks druppels en incubeer totdat cel platen of aggregaten hebben gevormd.
- Eenmaal vellen vorm, kunnen ze worden overgebracht naar ronde bodem glas shaker kolven met 3 ml van compleet medium en geïncubeerd in een schuddend waterbad bij 37 ° C en 5% CO 2 tot sferoïden te vormen.
Totale formatie van de cel sheet methode:
- Eencellige suspensies worden bereid zoals hierboven beschreven, maar de concentratie is ingesteld op 1x10 6 cellen / ml.
- Overdracht 3 ml van de celsuspensie met 10 ml rondbodemkolven (Belco, Vineland, New Jersey).
- Incubeer kolven in een tolbrekers waterbad / shaker (New Brunswick Scientific, Edison, NJ) bij 37 ° C, 5% CO 2 voor 4 uur bij 120 rpm tot cellen te herstellen van trypsine.
- Overdracht cellen om een glazen ronde bodem centrifugebuis en centrifugeer bij 200 X g in een dunne pellet. Incubeer nog 24 uur tot een coherente plaat vormt.
- Zwenk de cultuur buis om het vel los en giet de inhoud van de cultuur buis in een kleine, steriele glazen weefselkweek schotel.
- Gebruik micro scalpels om de platen in stukjes geknipt van verschillende afmetingen.
- Incubeer fragmenten bij 37 ° C aan de tolbrekers waterbad shaker bij 120 rpm minder dan 5% CO 2 voor 2 tot 3 dagen of totdat ze bolvormig.
2. Meting van de totale oppervlaktespanning
- Het weefsel oppervlak tensiometer. Het apparaat is getoond in Fig. 1 en 2. De compressie cel (afb. 3) is samengesteld uit twee kamers. De buitenste kamer (OC) is aangesloten op een 37 ° C circulerende water pomp, en dient te reguleren de temperatuur van de binnenkamer (IC). De kamers zijn gemaakt van gemalen Delrin en bevatten kwarts ramen voor visualisatie van de aggregaat. De lagere montage (LA) schroeven in de onderkant van de binnenkamer en wordt gebruikt om 1) de positie van de totale in de binnenkamer, 2) afdichting van de bodem van de binnenste kamer, 3) verheffen de totale om compressie te starten, en (4 ) de controle van de afstand tussen de parallelle platen en daarmee de compressie van het aggregaat. De centrale kern (CC) van de montage is instelbaar. De tip van de centrale kern (het voetstuk) bestaat uit glad Teflon en fungeert als de lagere compressie plaat (LCP). De bovenste plaat compressie (UCP) is een Teflon cilinder 15 mm lang, dat uit de balans arm hangt (B) door een vlam-rechtgebogen nikkel-chroom draad (NCW) *. In de loop van een experiment, is de cel totaal (A) geplaatst op de onderste plaat en opgevoed tot hij contact maakt met de bovenste plaat. De bovenste plaat is verbonden met de balans arm (B). Compressie van de totale oorzaken verplaatsing van de balans arm. De balans is een Cahn / Ventron model 2000 opname elektrobalans, die werkt op de nul-saldo principe. Het steunpunt van het saldo arm heeft een armatuur binnen een permanent magnetisch veld. Wanneer de balans in werking is, moduleert continu de stroom die door de elektromagnetische montage, die op zijn beurt houdt de balans arm in de horizontale positie. Wanneer een object is opgehangen aan de balans arm, de spanning, waardoor het saldo van toepassing is op de arm te houden in de horizontal positie, is evenredig af te wegen van het object. Deze spanning meet de externe drukkracht toegepast op de aggregaat. De totale de vorm wordt gecontroleerd door visuele waarneming door middel van een 25 x Nikon SMZ10A stereoscoop gekoppeld aan een computer die is uitgerust met een frame grabber. Om de hechting van de cel aggregaten voor de compressie platen te minimaliseren, zowel de onderste en bovenste compressie platen werden bekleed met poly (2-hydroxyethylmethacrylate) {poly (HEMA)}, een polymeer materiaal om welke cellen niet houden 16.
* De draad is vlam-rechtgetrokken door opknoping een 15-inch lengte van de draad van een statief en klemmen een klein bindmiddel clip aan het einde. Een bunsenbrander is dan rennen op en neer de lengte van de draad tot aan de draad gloeit rood. De rechtgetrokken draad kan dan worden gesneden in de juiste lengtes. Een kleine haak wordt gevormd door het buigen van de draad ongeveer ¼ van een duim van het einde met twee scheermesjes. Het andere uiteinde wordt vervolgens ingebracht in de loop van de lagere compressie plaat. - Aggregate compressie.
- De binnenste kamer is gevuld met voorverwarmd CO 2-onafhankelijke weefselkweek medium (Gibco / BRL, NY).
- Aggregaten variërend in grootte van ongeveer 200-300 μ bevinden zich op de lagere compressie plaat (Fig. 4A). Aggregaten worden geladen door aspireren een aggregaat in weefselkweek medium halverwege de punt van een Pasteur pipet voorzien van een siliconen lamp, de overdracht van de pipet om de binnenkamer, en de positionering van de punt van de pipet boven de LCP. Het aggregaat is dan zacht verdreven op de LCP door zachtjes knijpen de lamp. Als alternatief, is het totaal toegestaan om door de zwaartekracht vallen op de LCP.
- De bovenste plaat compressie (UCP) is gepositioneerd boven de aggregaat en bezinken, tot oprichting van een pre-compressie zichtbaar UCP gewicht baseline.
- Het LCP wordt dan omhoog gebracht tot de totale gecomprimeerd tegen het UCP (Fig. 4B). Het aanpassen van de hoogte van de kern van de lagere apparaat zal de controle een verschillende mate van compressie. Compressie wordt gecontroleerd door observatie door middel van een dissectiemicroscoop uitgerust met een CCD-videocamera.
- Aggregaat beelden worden vastgelegd, gedigitaliseerd en geanalyseerd met behulp van ImageJ. Schijnbare UCP verandering in gewicht wordt continu geregistreerd op een papierbandschrijver, de verwezenlijking van de vorm evenwicht wordt aangeduid door de afvlakking van de spanning van de Cahn balans van de output. Elk aggregaat wordt onderworpen aan twee verschillende graden van compressie.
- Berekening van de totale oppervlaktespanning.
Op vorm evenwicht, kan de cohesivity van een aggregaat van cellen samengedrukt tussen parallelle platen waarop zij zich niet houdt zijn verkrijgbaar bij de Young-Laplace vergelijking (Fig. 5), waarbij σ is cohesivity, F is de kracht die op de som te comprimeren , πr 3 2 is het gebied van het oppervlak van het aggregaat, waarop kracht F wordt uitgeoefend, en R 2 en R 3 zijn respectievelijk de straal van de evenaar van de gecomprimeerde aggregaat en de straal van een boog het definiëren van het oppervlak profiel normale aan de comprimeren platen en zich uitstrekt tussen hen (Fig. 6). Het meten van de drukkracht en de geometrie van kracht en vorm van evenwicht en het toepassen van deze metingen aan de Young-Laplace vergelijking genereert numerieke waarden van schijnbare weefsel oppervlaktespanning. Bij het bereiken van evenwicht en de berekening van σ 1, aggregaten zijn gedecomprimeerd en liet een tweede evenwicht aanpak en 2 wordt berekend zoals hierboven beschreven σ. - Bevestiging van de totale liquiditeit.
De berekende oppervlaktespanning van een vloeistof aggregaat, zal wanneer het wordt blootgesteld aan twee verschillende compressies constant blijven. In dergelijke aggregaten de verhouding van σ 2 / σ 1 zal gelijk zijn aan 1 en zal lager zijn dan de verhouding van de kracht toegepast bij elke opeenvolgende compressie (F 2 / F 1). In tegenstelling, zal de berekende oppervlaktespanning van een elastische aggregaat gehoorzamen de wet van Hooke en verhogen in verhouding tot de uitgeoefende kracht. Voor elastische aggregaten de verhouding σ 2 / σ 1 zal niet gelijk zijn aan 1, maar in plaats daarvan aanpak van de verhouding van twee F / F 1. De oppervlaktespanning van de vloeistof aggregaten zal ook onafhankelijk zijn van de totale grootte van 2,17. Alleen metingen waarin de oppervlaktespanning is onafhankelijk van de toegepaste kracht en de grootte worden gebruikt om de gemiddelde σ voor elke cellijn te berekenen.
3. Representatieve resultaten:
Hieronder is een tabel met typische TST resultaten voor aggregaten van rat prostaat fibroblasten (RPF) en de rat prostaat gladde spiercellen (RPSMC). Zoals kan worden gezien in Fig. 7 aggregaten van de RPF-cellen hebben een oppervlakte spanning van 22,8 ± 1,1 dynes / cm. Bovendien is de gemiddelde oppervlaktespanning gemeten waarden na compressie 1 en na compressie twee waren statistisch identical in vergelijking met een gepaarde t-test. We hebben ook ten opzichte van de verhoudingen van σ 2 / σ 1 en F 2 / F 1 om ervoor te zorgen dat deze aggregaten niet de wet van Hooke te gehoorzamen, omdat zij zou doen als ze zich gedroegen als elastische vaste stoffen. Zoals aangetoond in tabel 1, de verhouding van σ 2 / σ 1 inderdaad 1,0 aanpak. Bovendien is de verhouding van twee F / F 1 was significant groter dan σ 2 / σ 1 (gepaarde t-test, P <0.05), verder te bevestigen dat deze aggregaten niet de wet van Hooke gehoorzamen en in feite gedragen zich als vloeistoffen. In tegenstelling RPSMCs gehoorzaamde de wet van Hooke. Zoals blijkt uit tabel 1, de verhouding van σ 2 / σ 1 is aanzienlijk groter dan 1 en was niet statistisch significant verschillend dan die van F 2 / F 1. Om verder aan te tonen vloeistof-achtig gedrag, onderzochten we de relatie tussen de oppervlaktespanning (σ) en de totale volume. Zoals kan worden gezien in Fig. 8, het volume is onafhankelijk van sigma voor de RPF-cellen (rode regressielijn, r 2 = 0.002), terwijl er lijkt een afhankelijkheid van de Sigma op de volume voor RPSMCs (blauwe regressielijn, r 2 = 0.146). Deze gegevens bevestigen verder dat RPF aggregaten gedragen in een vloeistof-achtige manier, terwijl die van RPSMCs blijken meer gedragen als elastische vaste stoffen. Alleen die Maatvoering verkregen van aggregaten gedragen als vloeistoffen zouden worden gebruikt om de oppervlaktespanning te berekenen.
Figuur 1. Overzicht van het weefsel oppervlak tensiometer.
Figuur 2. Een meer gedetailleerd overzicht van de tensiometer kamer (rechter paneel).
Figuur 3. Schematische weergave van de tensiometer kamer.
Figuur 4. Beelden van niet-gecomprimeerde (A) en gecomprimeerd (B) aggregaten.
Figuur 5. De Laplace-vergelijking.
Figuur 6. Schematische weergave van een druppel vloeistof samengedrukt tussen twee parallelle platen waaraan het voldoet slecht, bij SHAPE evenwicht. R 1 en R 2 zijn de twee belangrijkste krommingsstralen, op de evenaar van de druppel en in een vlak door de as van symmetrie, respectievelijk. R 3 is de straal van de cirkel de druppel op gebied van contact met zowel compressie plaat. H is de afstand tussen de bovenste en onderste compressie platen. X is een kant van een rechthoekige driehoek met schuine zijde R 2 uit te breiden tot een punt van contact tussen het oppervlak van de druppel en de beide compressie plaat.
| σ 1 (dynes / cm ± SEM) | σ 2 (dynes / cm ± SEM) | Pσ 1 vs σ 2 | σ 1,2 (dynes / cm ± SEM) | σ 2 / σ een | F 2 / F 1 | Pσ 2 / σ 1 en F 2 F 1 | |
| RPF | 22,6 ± 1,7 | 22,9 ± 1,4 | > 0,05 * | 22,8 ± 1,1 | 1,04 ± 0,04 | 1,47 ± 0,06 | <0,05 |
| RPSMC | 15,0 ± 2,8 | 23,0 ± 3,2 | 0.039 | NA | 1,9 ± 0,3 | 1,6 ± 0,1 | 0,16 * |
Figuur 7. TST metingen en de bevestiging van de totale liquiditeit voor aggregaten van rat prostaat fibroblasten en gladde spiercellen.
Figuur 8. Verband tussen sigma en het volume voor aggregaten van RPF (rode lijn) en RPSMCs (blauwe lijn).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het meten van de totale samenhang door TST is relatief eenvoudig. Er zijn echter belangrijke stappen die moeten worden beheerst om bruikbare TST gegevens te produceren; 1) aggregaten moeten zijn "gezond". Dit kan worden gecontroleerd door ervoor te zorgen dat de totale formatie begint met cellen die zijn op een optimale samenvloeiing voorafgaand aan de onthechting. Aggregate omvang en tijd in cultuur moet ook worden gecontroleerd om de ontwikkeling van een necrotische kern binnen de totale minimum te beperken, 2) Een andere parameter die van invloed kunnen TST metingen is de mate van hechting van het aggregaat aan de bovenste of onderste compressie platen. Dienovereenkomstig, de optimale concentratie van poly-HEMA gebruikt voor het bekleden van de platen dient empirisch te worden bepaald voor elk type aggregaat, 3) Hoewel het de voorkeur dat de pre-compressie aggregaten moet zo bolvormig mogelijk, is het niet strikt noodzakelijk is. Sommige aggregaten, in het bijzonder degenen die worden gehouden zwak bij elkaar, niet geneigd zijn om een perfecte bollen te vormen. De verklaring hiervoor is dat met het oog op volledige round-up cellen moeten energie verbruiken door het verplaatsen en opnieuw arrangeren. Als de hoeveelheid energie die nodig is om weer op ronde in een bol groter is dan de energie-minimalisering van het worden sferische, zal de aggregaten hebben de neiging om kraam op een sub-sferische vorm. In onze ervaring, zoals aggregaten op worden gecomprimeerd, weerstaan aan de drukkracht in een mate die de zijkanten van de geaggregeerde vorm halve cirkels, precies zoals ze zouden doen als uitgaande van een perfecte bol, 4) Het is ook belangrijk dat de compressie-platen parallel aan een andere. Dit kan het beste bereikt door ervoor te zorgen dat de nikkel-chroom draad is recht en dat het instrument waterpas en schietlood. Als deze maatregelen in acht worden genomen, weefseloppervlak tensiometry is relatief eenvoudig en kan genereren zeer nuttige informatie over de mechanische eigenschappen van weefsels en van hun onderliggende moleculaire determinanten.
Andere methoden voor het meten van de totale samenhang bestaan, een aantal dat de behoefte aan speciale apparatuur zoals de Cahn elektrobalans te elimineren. Een dergelijke methode zuigt een sferoïde in een pipet van veel kleinere diameter dan die van de sferoïde, met een constante zuigdruk. De visco-elastische eigenschappen van het weefsel zijn afgeleid van de variatie van de stam door het meten van de verandering in de lengte van het mobiele materiaal als het stroomt binnen in de pipet 18. Hoewel nuttig, kan deze methode hebben beperkingen met betrekking tot het bereik van oppervlaktespanningen waarin het kan worden toegepast. Zeer zwak aggregaten zou waarschijnlijk worden vernietigd als ze zijn opgezogen in de pipet, terwijl aggregaten die bij elkaar worden gehouden heel sterk kan helemaal niet worden opgezogen. Parallelle plaat compressie is gemeten oppervlakte spanningen zo laag als 0,33 ± 0,02 dynes / cm voor de zebravis kiemlaag ectoderm die behandeld worden met E-cadherine morfolino 3 tot zo hoog als 20,1 ± 0,5 dynes / cm voor de aggregaten van de embryonale kuiken ledematen knop mesoderm 2, demonstreren van zijn algemeen nut over een breed scala samenhang voor verschillende embryonale systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| water bath/shaker | New Brunswick Scientific | ||
| 10 ml round-bottom flasks | Bellco Glass |
References
- Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions. Phys Rev Lett. 72, 2298-2301 (1994).
- Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122, 1611-1620 (1996).
- Schotz, E. -M. Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning. HFSP Journal. 2, 42-56 (2008).
- Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).
- Schwarz, M. A., Zheng, H., Legan, S., Foty, R. A. Lung Self-Assembly is Modulated by Tissue Surface Tensions. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2010).
- Ryan, P. L., Foty, R. A., Kohn, J., Steinberg, M. S. Tissue spreading on implantable substrates is a competitive outcome of cell-cell vs. cell-substratum adhesivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4323-4327 (2001).
- Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Dev Biol. 278, 255-263 (2005).
- Robinson, E. E., Foty, R. A., Corbett, S. A. Fibronectin matrix assembly regulates alpha5beta1-mediated cell cohesion. Mol Biol Cell. 15, 973-981 (2004).
- Robinson, E. E., Zazzali, K. M., Corbett, S. A., Foty, R. A. alpha5beta1 integrin mediates strong tissue cohesion. J Cell Sci. 116, 377-386 (2003).
- Winters, B. S., Raj, B. K., Robinson, E. E., Foty, R. A., Corbett, S. A. Three-dimensional culture regulates Raf-1 expression to modulate fibronectin matrix assembly. Mol Biol Cell. 17, 3386-3396 (2006).
- Caicedo-Carvajal, C. E., Shinbrot, T., Foty, R. A. Alpha5beta1 integrin-fibronectin interactions specify liquid to solid phase transition of 3D cellular aggregates. PLoS One. 5, e11830-e11830 (2010).
- Foty, R. A., Steinberg, M. S. Measurement of tumor cell cohesion and suppression of invasion by E- or P-cadherin. Cancer Res. 57, 5033-5036 (1997).
- Foty, R. A., Corbett, S. A., Schwarzbauer, J. E., Steinberg, M. S. Dexamethasone up-regulates cadherin expression and cohesion of HT-1080 human fibrosarcoma cells. Cancer Res. 58, 3586-3589 (1998).
- Winters, B. S., Shepard, S. R., Foty, R. A. Biophysical measurement of brain tumor cohesion. Int J Cancer. 114, 371-379 (2005).
- Foty, R. A., Cummings, K. B., Ward, S. Tissue surface tensiometry: a novel technique for predicting invasive potential of prostate tumors based on tumor cell aggregate cohesivity in vitro. Surgical Forum L. , 707-708 (1999).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Foty, R. A., Forgacs, G., Pfleger, C. M., Steinberg, M. S. Liquid properties of embryonic tissues: Measurement of interfacial tensions. Physical Review Letters. 72, 2298-2301 (1994).
- Guevorkian, K., Colbert, M. J., Durth, M., Dufour, S., Brochard-Wyart, F. Aspiration of biological viscoelastic drops. Phys Rev Lett. 104, 218101-218101 (2010).
