Summary
液为基础的培养和分配过程
Abstract
高通量筛选（HTS）是一个强大的方法确定的生物过程的化学调制。然而，在使用细胞培养模型的屏幕中发现了许多化合物， 经常 发现 在 1-2体内有毒或药物活动。在整体动物模型的筛选，可以帮助避免这些缺陷，并简化药物开发的路径。
线虫是一个多细胞生物模型，非常适合用于高通量筛选。这是小（<1毫米），并可以在经济上的培养，在液体中的处方。 C。 线虫也是最听话的实验动物模型允许快速和详细的鉴定药物模式的行动之一。
我们描述了培养协议，并配发荧光的 C株线虫为高通量筛选化学库或改变特定基因的表达的环境污染物的检测。发展同步蠕虫的大量液体培养基中生长，收获，洗涤，并悬浮在一个定义的密度。蠕虫，然后添加到黑，平底的384孔板使用蠕动的液体分配器。从一种化学品库或测试样本（例如，水，食物，或土壤）的小分子可以被添加到井与蠕虫体内，实时荧光强度与荧光酶标仪测定。这种方法可以适应任何C.诱导基因一个合适的记者提供的线虫。许多诱导应力和发展的转录途径是定义在 C 线虫和GFP的转基因记者菌株已经存在许多其中4人。当与适当的转基因记者结合，我们的方法可用于屏幕通路调制器，或发展为强大的生物传感器检测环境污染物。
我们证明我们的C 。 线虫文化和配药协议，高温超导实验，我们发展到显示器的 C. 线虫第“N”白领转录因子SKN - 1。 SKN - 1和哺乳动物同源Nrf2的激活过程中的氧化和异生强调5-10细胞保护基因。 Nrf2的保护哺乳动物和许多与年龄有关的，如癌症，神经退行性疾病，和慢性炎症疾病已成为一个主要的化疗目标11-13。我们的实验是基于GFP的转基因SKN - 1靶基因 GST -4 14记者，编码谷胱甘肽- S转移6。 商品及服务税-4记者也是一个传感器异生和氧化的化学物质，激活SKN - 1，可用于检测水平低的污染物，如丙烯酰胺和甲基水银15-16。
Protocol
1。细菌的蠕虫食品的制备
第1天
- 加入5毫升饱和大肠杆菌大肠杆菌 OP50细菌培养到500毫升了不起的肉汤补充50微克/ ml链霉素和成长在一个摇床（225转）隔夜在37 ° C。
第2天
- 2500 RCF为20分钟，分割成10个50毫升管和一个冷冻离心机离心机细菌过夜的细菌培养。
- 倒出关闭LB培养基，并在每10毫升的液体线虫的生长介质（NGM）重悬菌体。握在地板摇床水平为15分钟悬浮细菌。为了使NGM的缓冲区，添加3 g氯化钠至1 L去离子水和高压灭菌。冷却至55 ° C，并在顺序添加无菌解决方案如下：1毫升1个M 氯化钙 ， 硫酸镁的1 M 1毫升，25毫升1 M磷酸钾，pH值6.0。
- 在冷冻离心机离心20分钟，在2500 RCF的细菌培养。
- 倒出关闭NGM的缓冲区，并权衡菌体。
- 添加NGM的缓冲液等体积的悬浮颗粒，等分3毫升细菌集中到15毫升的试管，并储存在-20 ° C。
2。大规模C.线虫液体培养
我们使用了转基因株系VP596（dvIs19 [pAF15（GST - 4：：GFP：免入息审查贷款计划 ）]; vsIs33 DOP - 3：RFP），携带两个 荧光结构：Pgst -4：：GFP 的 14监察SKN - 1活动和PDOP - 3：RFP的 17作为一个蠕虫号码规范化标准。
第1天
- 混合150毫升NGM的缓冲液，1.5毫升的LB肉汤，150μL5 mg / ml的胆固醇（乙醇），100毫克/ ml链霉素和75μL。过滤消毒的混合物，并添加1升的无菌烧瓶。
注：NGM的缓冲液中添加1％LB肉汤有助于坚持玻璃器皿和塑料制品，以防止蠕虫，但这一数额是不够的支持细菌生长。 - 同步标准次氯酸钠蠕虫程序18。在一个15毫升管次氯酸钠溶液5毫升（3.75毫升无菌水，1毫升的家用漂白剂，和250μL10 N的氢氧化钠）可处理多达0.5毫升妊娠蠕虫。发布鸡蛋用无菌水清洗和重新悬浮在10毫升NGM的缓冲区。
- 稀释100倍NGM的缓冲区（例如，100μL于10 ml）的鸡蛋样本，并在三个独立的5μL分装鸡蛋的数量计数。多200,000（100稀释倍数x 2000）的平均人数估计总数的鸡蛋。
- 新增20万到2万只鸡蛋NGM的缓冲瓶和动摇的文化，在100转20 ° C。
第2天
- 烧瓶中加入鸡蛋，至少有16小时后使用无菌血清吸管取出约0.5毫升悬浮蠕虫文化。吸取三个5μL下降到无菌培养皿盖子。在-20 ° C冰箱中放置1-2分钟瘫痪蠕虫的盖子。计数孵化每5μL，然后由30000（150毫升/ 5μL）多活蠕虫的平均人数估计总数孵出的蠕虫。
- 解冻一管冷冻OP50细菌培养议定书“（1.6）和3毫升50％OP50添加到每50万孵出的蠕虫蠕虫文化。摇烧瓶中，在100转20 ° C。蠕虫会发展成L4幼虫，并在51小时左右的青壮年。开始时，细菌的OD600值应约为2.200。监测细菌的吸光度量和添加更多的外径600下降到低于0.900。
3。蠕虫收集和配药
第4天
- 使用无菌血清吸管转移约0.5毫升悬浮蠕虫文化，一个标准的NGM琼脂平板。立体显微镜，以确保大多数是L4幼虫或青壮年蠕虫。 L4幼虫会在身体的中间有一个腹斑点清晰。年轻的成年人将稍大，不会有一个明确的点。
- 倒入无菌50毫升管蠕虫的文化，并将其放置在试管架台式管。允许蠕虫解决约10分钟。取出吸入或移液上清。
注意：这一步也很重要，以除去未孵化的鸡蛋或蠕虫没有发展，因为他们将解决速度比L4幼虫和年轻的成年人。 - 收集到一个单管50毫升和1％的LB肉汤（NGM +的LB）3-4次，以去除细菌NGM的缓冲区清洗所有的蠕虫。
注：这是最好的蠕虫为30秒500 RCF通过收集和更换新鲜NGM +的LB缓冲区上清液中摆动桶离心机。 - 洗涤后，填写NGM管+的LB缓冲至50毫升，倒入一个自定义的蠕虫配药烧瓶。添加一个小搅拌棒，搅拌暂停保持蠕虫。数日E的蠕虫数量在3个5μL滴如上。 NGM +的LB稀释，直到你每5μL滴（〜2.5-3.0蠕虫/μL）12-15蠕虫。
注：约20毫升（60,000蠕虫）最低需要填补配药烧瓶和饮水机卡带的死腔。每384孔板需要约35000蠕虫或暂停蠕虫的11.5毫升。 - 负载10μL配药卡带和消毒用70％乙醇的吸。吸用无菌水冲洗出来的乙醇。
- 因此，它只是上述不影响其运动的情况下，搅拌棒插入到烧瓶配药卡带年底。确保蠕虫仍然在整个烧瓶暂停。计划饮水机，免除在低速2预脉冲。总理和运行至少10毫升的暂停蠕虫。填写需要迅速解决油管，以防止蠕虫的板。
- 透气胶带密封板。
- 放置在孵化器的平台，在适当的温度，为您的检测握手的板块。请勿堆叠板。
4。荧光分析
- 目标板放入酶标仪测量每口井的荧光强度与相应的发射和激发波长（我们的检测过滤器：GFP 485/20ex 528/20em; RFP的540/25ex 590/35em）。
- 计算GFP / RFP的比例正常化，并与对照孔（不激活化合物）的读数从个别治疗所产生的荧光强度，以确定确切倍的差异。
5。代表性的成果：
我们的SKN - 1法使用一个染色体整合双记者株（VP596）。正如图1所示，蠕虫以及相关量配药。在每口井的图2A和2B，总GFP和RFP的荧光显示的高度重复性，以及跨384孔板。如图所示，图2C，联合国诱导Pgst - 4：：GFP荧光线性关系PDOP - 3：RFP的跨384孔。当作为一个比GFP / RFP表达，荧光变得高度重复性以及跨384孔板展示PDOP - 3的能力（比较从图2D到2A的变异系数）从：RFP的记者，以减少变异。如在图3中，RFP与GFP的相对感应所示的一个SKN - 1激活异生（38微米胡桃）是强大的和高度跨384孔板的重复性。
图1。蠕虫与量数配发。蠕虫分别稀释至约2/μl和配发到24孔板与体视显微镜手动计数。 N = 8口井每卷。
图2到384孔板配发蠕虫的总荧光重现。配发到每一个384孔板以及蠕虫稀释至约2.5/μl和30μL。 GFP（一）和RFP（二）荧光所有井的变异系数低于9％。 （三）绿色荧光高度相关RFP的荧光。 （四）计算RFP的绿色荧光蛋白的比例减少的变异系数低于6％（A，B，和D）的实线表示的手段和虚线表示三个高于或低于平均值的标准偏差。
图3激活Pgst - 4：绿色荧光蛋白是强大的和一致的。配发到一个384孔板和38微米胡桃所有井约75 L4蠕虫中添加了其他所有列。 GFP和RFP的荧光测定孵化后21 h。平均相对荧光比率（1.0）的所有控制和胡桃井（8.9）都标有实线。控制上述三个标准差的均值和胡桃意味着下面的虚线标记。
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Discussion
我们提出了培养方法，并配发大量的转基因线虫。培养蠕虫使用的设备是标准的实验室进行分子克隆和液体处理和设备的荧光微孔板处理大量的实验室标准。配药的活C.大量的其他方法线虫需要昂贵的粒子分拣设备19。 Pgst - 4：绿色荧光蛋白检测可用于屏幕上的第“N”白领转录因子的小分子调制器和检测异生和氧化剂污染物在环境和食品样品14,16。乐百氏诱导转基因GFP的记者可用于范围广泛的途径和环境刺激4，并因此我们的方法应适用于许多途径发展的调制和广谱检测的污染物。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
线虫转基因线虫遗传学中心（美国明尼苏达大学，明尼阿波利斯，明尼苏达州）。这项工作是支持由美国国立卫生研究院R21授予NS0667678 - 01到金水。参加所有作者在收集，分析和解释数据。 CKL，KS和KPC参加了编写和修改的手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled(352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nalge Nunc international | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone)Juglone | Acros Organics | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
References
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