Summary
הליך culturing נוזלי מבוסס מחלק של
Abstract
תפוקה גבוהה ההקרנה (HTS) היא גישה חזקה לזיהוי מאפננים כימיים של תהליכים ביולוגיים. עם זאת, תרכובות רבות שזוהו באמצעות מסכי התרבות מודלים התא נמצאים לעתים קרובות להיות רעילים או פעילים פרמקולוגית in vivo 1-2. הקרנת במודלים של בעלי חיים שלם יכול לעזור למנוע מהמלכודות הללו ולייעל את הדרך לפיתוח תרופות.
סי אלגנס הוא אורגניזם מודל תאיים גם מתאים HTS. הוא קטן (<1 מ"מ) יכול להיות מתורבת כלכלית לוותר על נוזלים. ג elegans הוא גם אחד במודלים של בעלי חיים הכי ממושמע בניסוי המאפשר זיהוי מהיר ומפורט של התרופה למצב של פעולה 3.
אנו מתארים פרוטוקול עבור culturing מחלק זנים הניאון של C. elegans להקרנה תפוקה גבוהה של ספריות כימי או זיהוי של מזהמים סביבתיים אשר משנים את הביטוי של גן מסוים. כמות גדולה של תולעים מסונכרן התפתחותית גדלים בתרבות נוזלי, שנקטפו, התרחצתי, תלוי בצפיפות מוגדר. תולעים מתווספים ואז שחור, השטוחה 384 גם באמצעות צלחות מנפק נוזל peristaltic. מולקולות קטנות מספריית כימיים או דגימות הבדיקה (למשל, מזון, מים או אדמה) ניתן להוסיף בארות עם תולעים. In vivo, בזמן אמת, עוצמת הקרינה נמדדת עם הקורא microplate פלואורסצנטי. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לכל גן ועין מתנהלת ב C. elegans עבורו כתב מתאים זמין. הלחץ ועין מתנהלת הרבה מסלולים תעתיק התפתחותיים מוגדרים היטב ב C. elegans ו-GFP זנים מהונדס כתב כבר קיים עבור רבים מהם 4. בשילוב עם הכתבים מהונדס מתאים, השיטה שלנו יכולה לשמש מסך עבור מאפננים מסלול או לפתח מבחני biosensor חזקים מזהמים סביבתיים.
אנו מדגימים C. שלנו elegans תרבות מחלק פרוטוקול עם assay HTS שפיתחנו כדי לפקח על C. 'n' אלגנס כובע גורם שעתוק צווארון SKN-1. SKN-1 ו Nrf2 יונקים שלה homologue להפעיל גנים cytoprotective במהלך סטרס חמצוני xenobiotic 5-10. Nrf2 מגן יונקים מגיל בהפרעות הקשורות רבות כגון סרטן, ניוון מוחיים, דלקת כרונית הפכה ליעד מרכזי כימותרפיות 11-13. Assay שלנו מבוססת על עיתונאי ה-GFP מהונדס עבור SKN-1 היעד הגן GST -4 14, אשר מקודד גלוטתיון-s 6 transferase. הכתב GST -4 גם biosensor כימיקלים xenobiotic ו חמצוני כי להפעיל SKN-1 והוא יכול לשמש כדי לזהות רמות נמוכות של מזהמים כגון acrylamide ו-מתיל כספית 15-16.
Protocol
1. הכנת מזון תולעת חיידקי
יום 1
- הוסף 5 מ"ל של E. רווי coli OP50 התרבות חיידקים ל -500 מ"ל מרק נהדר בתוספת סטרפטומיצין מיקרוגרם / מ"ל ו - 50 לגדול חממה רועד (225 סל"ד) לילה בשעה 37 ° C.
יום 2
- פיצול התרבות חיידקים לילה לעשרה צינורות 50 מ"ל חיידקים צנטריפוגות בצנטריפוגה בקירור ב RCF 2500 במשך 20 דקות.
- למזוג את המרק LB ו resuspend כל גלולה חיידקי 10 מ"ל של נוזל צמיחה התקשורת נמטודות (NGM). Shake אופקית רצפה שייקר במשך 15 דקות כדי resuspend את החיידקים. כדי להפוך את המאגר NGM, להוסיף 3 גרם NaCl למים 1 L החיטוי deionized ו. מצננים 55 ° C ולהוסיף כדי הפתרונות סטרילי הבאים: 1 מ"ל של 1 M CaCl 2, 1 מ"ל של 1 M MgSO 4, 25 מ"ל של M 1 פוספט אשלגן, 6.0 pH.
- צנטריפוגה התרבות חיידקים בצנטריפוגה בקירור ב RCF 2500 במשך 20 דקות.
- למזוג את החיץ NGM ולשקול את גלולה חיידקי.
- הוסף נפח שווה של חיץ NGM כדי resuspend את כדורי, aliquot 3 מ"ל של חיידקים להתרכז לתוך צינורות 15 מ"ל, ולאחסן ב -20 ° C.
2. בקנה מידה גדול C. elegans נוזלי תרבות
אנו משתמשים בקו מהונדס VP596 (dvIs19 [pAF15 (GST-4:: GFP: NLS)]; vsIs33 [DOP-3: RFP]) נושא שני מבנים ניאון: Pgst -4: 14-GFP כדי לפקח SKN-1 פעילות Pdop-3: 17 RFP לשמש תקן לנורמליזציה מספר התולעת.
יום 1
- מערבבים 150 מ"ל NGM חיץ, 1.5 מ"ל מרק LB, 150 μl של כולסטרול מ"ג / 5 מ"ל (ב אתנול), וכן 75 μl של סטרפטומיצין מ"ג / 100 מ"ל. מסנן לעקר את התערובת ולהוסיף בבקבוק סטרילי 1 ליטר.
הערה: הוספת מרק LB 1% למאגר NGM מסייעת במניעת תולעים מן דבק זכוכית plasticware, אך סכום זה אינו מספיק כדי לתמוך בצמיחה חיידקים. - סנכרון עם תולעים ההליך hypochlorite תקן 18. עד 0.5 מ"ל של תולעים הרה להולדת יכול להיות מעובד בצינור יחיד 15 מ"ל עם 5 מ"ל של תמיסת hypochlorite (3.75 מ"ל מים סטריליים, 1 מ"ל אקונומיקה הבית, 250 μl 10 N NaOH). לשטוף את הביצים שוחרר עם מים סטריליים resuspend אותם 10 מ"ל של חיץ NGM.
- מדולל מדגם של 100 ביצים לקפל NGM חיץ (למשל, 100 מ"ל ב μl 10), לספור את מספר ביצים בשלושה 5 aliquots נפרד μl. מספר ממוצע של 200,000 (100 גורם לדילול x 2000) כדי להעריך את המספר הכולל של ביצים.
- הוסף 200,000 ל -2 מיליון ביצים בקבוק עם חיץ NGM ולנער את התרבות בסל"ד 100 ב 20 ° C.
יום 2
- לפחות 16 שעות לאחר הוספת ביצים הבקבוק, השתמש pipet סרולוגיות סטרילי כדי להסיר כ 0.5 מ"ל של התרבות תולעת תנאי. Three Pipet 5 טיפות μl על המכסה סטרילית של בצלחת פטרי. מניחים את המכסה ב -20 ° C במקפיא במשך 1-2 דקות כדי לשתק את התולעים. הרוזן המספר הממוצע של תולעים בקעו חיים לכל 5 μl ולאחר מכן על ידי מספר 30000 (150 מ"ל / 5 μl) כדי להעריך את המספר הכולל של התולעים בקעו.
- הפשרה הצינור של התרבות חיידקי OP50 קפוא (1.6 פרוטוקול) ולהוסיף 3 מ"ל של 50% OP50 בתרבות תולעת לכל 500,000 התולעים בקעו. לנער את הבקבוק על סל"ד 100 ב 20 ° C. תולעים תתפתח הזחלים L4 וצעירים כ 51 שעות. OD600 של חיידקים יש על 2.200 בהתחלה. צג את כמות החיידקים על ידי ספיגת ולהוסיף עוד אם OD 600 יורד מתחת 0.900.
3. תולעת איסוף מחלק
יום 4
- השתמש pipet סרולוגיות סטרילי להעביר כ 0.5 מ"ל של התרבות תולעת מושעה עד צלחת NGM תקן אגר. הצג את התולעים עם stereomicroscope לוודא כי רוב L4 או זחלים צעירים. L4 הזחלים יהיה מקום ברור הגחון באמצע הגוף. לצעירים יהיה מעט גדול יותר לא יהיה מקום ברור.
- יוצקים את תרבות תולעת לתוך צינורות 50 מ"ל סטרילי והמקום צינורות במעמד מבחנה על benchtop. אפשר התולעים להסתפק בערך 10 דקות. הסר את supernatant על ידי שאיפה או pipetting.
הערה: שלב זה יכול להיות חשוב להסיר ביצים שלא נתבקעה או תולעים שלא לפתח, כי הם יסתפקו איטי יותר L4 הזחלים ומבוגרים צעירים. - לאסוף את כל התולעים לתוך צינור שטיפה 50 מ"ל יחיד עם חיץ NGM עם מרק LB 1% (LB NGM +) 3-4 פעמים כדי להסיר את החיידקים.
הערה: זה נעשה כמיטב ידי איסוף תולעים בבית RCF 500 למשך 30 שניות והחלפת supernatant עם NGM טרי + חיץ LB בצנטריפוגה מתנדנד, דלי. - לאחר כביסה, למלא את הצינור עם NGM + חיץ LB כדי מ"ל 50 ויוצקים לתוך בקבוק תולעת אישית מחלק. הוספת בר קטן מערבבים ומערבבים כדי לשמור על התולעים על תנאי. ספירת המספר דואר של תולעים בשלוש 5 טיפות μl כפי שצוין לעיל. מדולל עם LB + NGM עד שאתה מקבל 12-15 תולעים לכל טיפת 5 μl (~ 2.5-3.0 תולעים / μl).
הערה: מינימום של כ -20 מ"ל (60,000 תולעים), יש צורך למלא את החלל המת של הבקבוק מחלק קלטת מנפק. כל צלחת 384 גם דורש כ -35,000 תולעים או 11.5 מ"ל של תולעים תנאי. - טעינת קלטת 10 מחלק μl ו לעקר ידי תחול עם אתנול 70%. שטפו את אתנול על ידי תחול עם מים סטריליים.
- הכנס את הקצה של הקלטת מחלק לתוך הבקבוק כך שיהיה בדיוק מעל הבר ומערבבים מבלי לשבש את התנועה. ודא כי את התולעים נשארים תלויים ברחבי הבקבוק כולו. תוכנית מנפק לוותר במהירות נמוכה עם 2 טרום פולסים. הממשלה לרוץ לפחות 10 מ"ל של תולעים תנאי. מלא צלחות הצורך במהירות כדי למנוע את התולעים להתיישב בצינור.
- חותם את הצלחות עם הקלטת לנשימה.
- מקמי את הצלחות על פלטפורמה רועד באינקובטור בטמפרטורה המתאימה assay שלך. אל ערימת הצלחות.
4. Fluorescence ניתוח
- מניחים את הצלחת לתוך היעד קורא microplate כדי למדוד את עוצמת הקרינה של כל אחד גם עם הגל הפליטה עירור המתאים (מסננים assay שלנו: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em).
- חישוב יחס ה-GFP / RFP ו לנרמל עם הקריאה של בארות הביקורת (ללא הפעלת המתחם) כדי לקבוע את ההבדל פי המדויק של עוצמת הקרינה נגזר טיפולים בודדים.
5. נציג תוצאות:
SKN-1 שלנו assay משתמש זן משולב chromosomally כתב כפול (VP596). כפי שמוצג באיור 1, מספר תולעים קשורה גם לנפח לוותר. כפי שמוצג איורים 2 א ו -2, GFP סך הקרינה לכל RFP גם הוא לשחזור מאוד מבאר לבאר פני צלחת 384 באר. כפי שניתן לראות בתרשים 2C, un-Induced Pgst-4: על פני 384 בארות RFP: GFP הקרינה קשורה באופן ליניארי על Pdop-3:. כאשר כפי שבאה לידי ביטוי ביחס של ה-GFP / RFP, הקרינה הופך לשחזור מאוד מבאר לבאר פני צלחת 384 באר (השוו מקדם השונות של איור 2D ל 2A) להדגים את היכולת של Pdop-3:: כתב RFP להפחית השתנות. כפי שמוצג באיור 3, הגיוס של קרוב ל GFP RFP עם SKN-1 הפעלת xenobiotic (38 מיקרומטר juglone) היא חזקה מאוד לשחזור פני צלחת 384 באר.
באיור 1. מספר תולעים לעומת נפח לוותר. תולעים היו מדולל כדי 2/μl כ וויתר לתוך צלחת 24 באר ספירה ידנית עם stereomicroscope. N = 8 בארות לפי נפח.
איור 2. פלואורסצנטי סך של תולעים לוותר לתוך צלחת 384 היטב ניתנת לשחזור. תולעים היו מדולל ל μl 2.5/μl כ ו 30 היה לוותר גם לתוך כל צלחת של 384 באר. GFP (א) ו - RFP (ב) הקרינה של כל הבארות היה מקדם השונות מתחת ל -9%. (ג) ה-GFP הקרינה קשורה מאוד RFP פלואורסצנטי. (ד) חישוב יחס ה-GFP כדי RFP הפחית את מקדם השונות אל מתחת ל -6% (A, B, ו-D) קווי מוצק לציין את האמצעים קווים שבורים לציין שלוש סטיות תקן מעל או מתחת מתכוון.
. איור 3 הפעלה של Pgst-4:: ה-GFP היא איתנה ועקבית. כ -75 L4 תולעים היו לוותר על כל הבארות של צלחת 384 באר juglone 38 מיקרומטר נוספה בכל טור אחרים. GFP ו RFP הקרינה נמדדה לאחר 21 שעות של דגירה. יחס ממוצע הקרינה היחסית של כל בקרה (1.0) ו juglone בארות (8.9) מסומנים קווי מוצק. שלוש סטיות תקן מעל לשלוט אומר ומתחת מתכוון juglone מסומנים קווים שבורים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציגים שיטה culturing מחלק מספר גדול של נמטודות מהונדס. הציוד המשמש תולעים culturing הוא סטנדרטי עבור מעבדות ביצוע שיבוט מולקולרי והטיפול נוזלי וציוד הקרינה הוא סטנדרטי עבור מעבדות לעיבוד כמויות גדולות של microplates. שיטות אחרות של מחלק מספר גדול של חיים ג elegans דורשים החלקיקים מיון ציוד יקר 19. Pgst-4:: assay GFP יכול לשמש המסך מאפננים מולקולה קטנה של גורמים צווארון 'n' כובע שעתוק לזהות מזהמים xenobiotic ו חמצון בדגימות סביבתיות מזון 14,16. יציבה ועין מתנהלת מהונדס לעיתונאים GFP זמינים עבור מגוון רחב של מסלולים ו - 4 לגירויים סביבתיים, ולכן השיטה שלנו צריכה להיות ישימה מאפננים בפיתוח מסלולים רבים לזהות ספקטרום רחב של מזהמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
סי אלגנס transgenes סופקו על ידי גנטיקה Caenorhabditis מרכז (אוניברסיטת מינסוטה, במיניאפוליס, מינסוטה). עבודה זו נתמכה על ידי NIH R21 מענק NS0667678-01 ל KS. כל המחברים שהשתתפו באוסף, ניתוח ופרשנות של נתונים. CKL, KS, ו KPC השתתפו בכתב לתיקון כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled(352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nalge Nunc international | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone)Juglone | Acros Organics | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
References
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery. Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).
- WormBase [Internet]. , Available from: http://www.wormbase.org (2012).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).
- Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).
- Hasegawa, K. Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).
- Tullet, J. M. A. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell. 132, 1025-1038 (2008).
- Oliveira, R. P. Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf. Aging Cell. , Forthcoming (2009).
- Park, S. -K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8, 258-269 (2009).
- Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. Antioxid Redox Signal. , (2010).
- Kwak, M. K., Kensler, T. W. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention. Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).
- Leiser, S. F., Miller, R. A. Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice. Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).
- Link, C. D., Johnson, C. J. Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).
- Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity. Toxicol Sci. , (2010).
- Hasegawa, K. A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food. Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).
- Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).
- Hope, I. A. C. elegans, a Practical Guide. , Oxford University Press. (2005).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).
