Summary
Um procedimento para líquidos baseados em cultura e distribuição de
Abstract
High-throughput screening (HTS) é uma poderosa abordagem para a identificação de moduladores de química de processos biológicos. No entanto, muitos compostos identificados em telas usando modelos de cultura celular são encontrados frequentemente para ser tóxicos ou farmacologicamente inativas in vivo 1-2. Triagem em modelos animais inteiros pode ajudar a evitar estas armadilhas e agilizar o caminho para o desenvolvimento de drogas.
C. elegans é um organismo multicelular modelo adequado para HTS. Ele é pequeno (<1 mm) e pode ser economicamente cultivadas e distribuídas em líquidos. C. elegans é também um dos modelos animais mais experimentalmente tractable permitindo identificação rápida e detalhada de drogas modo-de-acção 3.
Nós descrevemos um protocolo para cultivo e distribuição de linhagens fluorescentes de C. elegans para high-throughput screening de bibliotecas de química ou de detecção de contaminantes ambientais que alteram a expressão de um gene específico. Um grande número de worms developmentally sincronizado são cultivadas em cultura líquida, colhidas, lavadas e suspensas em uma densidade definida. Worms são então adicionados ao preto, de fundo chato de 384 poços placas utilizando um dispensador peristáltica líquido. Pequenas moléculas de uma biblioteca de produtos químicos ou amostras de teste (por exemplo, água, alimentos, solo ou) podem ser adicionados a poços com worms. In vivo, em tempo real intensidade de fluorescência é medida com um leitor de microplacas de fluorescência. Este método pode ser adaptado a qualquer gene induzível em C. elegans para o qual um repórter está disponível. Estresse induzível muitos caminhos e de desenvolvimento de transcrição são bem definidas em C. elegans e tensões repórter GFP transgênicos já existem em muitos deles 4. Quando combinado com os repórteres apropriado transgênicos, o nosso método pode ser utilizado para triagem de moduladores caminho ou para desenvolver robusto ensaios biosensor para os contaminantes ambientais.
Demonstramos nossa C. elegans cultura e dispensando protocolo com um ensaio HTS que desenvolvemos para monitorar o C. fator 'n' elegans cap transcrição colar SKN-1. SKN-1 e seu homólogo Nrf2 mamíferos ativar genes citoprotetora durante o estresse oxidativo e xenobióticos 50-10. Nrf2 protege mamíferos de várias doenças relacionadas à idade, tais como câncer, neurodegeneração, e inflamação crônica e se tornou um dos principais alvos quimioterápicos 11-13. Nosso ensaio é baseado em um repórter GFP transgênicos para o SKN-1 gene-alvo gst -4 14, que codifica a 6 glutationa-s-transferase. O repórter gst -4 é também um biosensor para produtos químicos xenobióticos e oxidativa que ativam SKN-1 e pode ser usado para detectar baixos níveis de contaminantes, como acrilamida e metil-mercúrio 15-16.
Protocol
1. Preparação de comida de verme bacteriana
1 dia
- Adicionar 5 ml de E. saturada coli ml caldo de cultura bacteriana OP50 a 500 Terrific suplementado com estreptomicina 50 mg / ml e crescer em uma incubadora de agitação (225 rpm) durante a noite a 37 ° C.
Dia 2
- Dividir a cultura de bactérias durante a noite em dez tubos de 50 ml e bactérias centrífuga em uma centrífuga refrigerada a 2500 rcf durante 20 minutos.
- Decantar caldo LB e ressuspender cada pellet de bactérias em 10 ml de líquido media nematóide de crescimento (NGM). Agitar horizontalmente em um piso shaker por 15 minutos para voltar a suspender as bactérias. Para fazer tampão NGM, adicionar 3 g de NaCl a 1 L de água deionizada e autoclave. Esfriar a 55 ° C e adicionar em ordem as seguintes soluções estéreis: 1 ml de CaCl 2 1 M, 1 ml de 1 M MgSO 4, e 25 ml de fosfato de potássio 1 M, pH 6,0.
- Centrifugar a cultura bacteriana em uma centrífuga refrigerada a 2500 rcf durante 20 minutos.
- Decantar tampão NGM e pesar o pellet bacteriano.
- Adicionar um volume igual de tampão NGM para ressuspender as pelotas, alíquota de 3 ml de bactérias se concentrar em tubos de 15 ml, e armazenar a -20 ° C.
2. Grande escala C. elegans cultura líquida
Nós usamos uma linhagem transgênica VP596 (dvIs19 [pAF15 (gst-4:: GFP:: NLS)]; vsIs33 [dop-3:: RFP]) carregando duas construções fluorescente: Pgst -4:: GFP 14 para monitorar SKN-1 atividade e PDOP-3:: RFP 17 para servir como um padrão para a normalização de número worm.
1 dia
- Misture 150 ml NGM buffer, 1,5 ml de caldo LB, 150 mL de 5 mg de colesterol / ml (em etanol) e 75 mL de estreptomicina 100 mg / ml. Filtro de esterilizar a mistura e adicionar a um frasco de 1 litro estéril.
NOTA: A adição de caldo LB 1% para tamponar NGM ajuda a evitar worms de degola para copos e plasticware, mas este montante não é suficiente para suportar o crescimento de bactérias. - Sincronizar worms com o procedimento padrão de hipoclorito de 18. Até 0,5 ml de vermes gravídico pode ser processado em um tubo única de 15 ml com 5 ml de solução de hipoclorito (3,75 ml de água estéril, uma lixívia ml, e 250 mL NaOH 10 N). Lave os ovos liberados com água estéril e ressuspender-los em 10 ml de tampão NGM.
- Diluir uma amostra do ovos 100 vezes na NGM buffer (por exemplo, 100 l em 10 ml) e contar o número de ovos em três diferentes alíquotas 5 mL. Múltiplos, o número médio de 200.000 (cem fator de diluição x 2.000) para estimar o número total de ovos.
- Adicionar 200 mil para 2 milhões de ovos para o frasco com tampão NGM e agitar a cultura em 100 rpm a 20 ° C.
Dia 2
- Pelo menos 16 h após a adição de ovos para o balão, use uma pipeta estéril sorológica para remover cerca de 0,5 ml da cultura verme suspenso. Pipetar 5 gotas três mL para a tampa estéril de uma placa de Petri. Coloque a tampa em um freezer -20 ° C por 1-2 minutos para paralisar worms. Conte o número médio de filhos nascidos worms por 5 mL e, em seguida, vários por 30.000 (150 ml / 5 mL) para estimar o número total de vermes nascidos.
- Descongelar um tubo de cultura bacteriana OP50 congelados (Protocolo 1.6) e adicionar 3 ml de 50% OP50 na cultura verme por 500.000 nascidos worms. Agitar o frasco a 100 rpm a 20 ° C. Vermes vão se desenvolver em larvas L4 e jovens adultos em cerca de 51 horas. O OD600 de bactérias deve ser cerca de 2,200 no início. Monitorar a quantidade de bactérias por absorbância e adicionar mais se o OD cai abaixo de 0,900 600.
3. Coleta e distribuição Worm
Dia 4
- Use uma pipeta estéril sorológica para transferir cerca de 0,5 ml da cultura verme suspensos a uma placa padrão NGM agar. Ver os vermes com uma lupa para se certificar de que a maioria são L4 larvas ou adultos jovens. L4 larvas terá um ponto ventral clara no meio do corpo. Jovens adultos será um pouco maior e não terá um ponto claro.
- Despeje a cultura verme em tubos de 50 ml estéril e colocar os tubos em um rack tubo de ensaio sobre a bancada. Permitir que os vermes que se contentar com cerca de 10 minutos. Retire o sobrenadante por aspiração ou pipetagem.
NOTA: Esta etapa pode ser importante para remover os ovos unhatched ou worms que não se desenvolveu porque eles vão resolver mais lento do que L4 larvas e adultos jovens. - Colete todos os worms em um único tubo de 50 ml e lavar com tampão NGM com caldo LB 1% (NGM LB +) 3-4 vezes para remover bactérias.
NOTA: Este é o melhor feito em uma centrífuga balançando-balde, recolhendo worms a 500 rcf durante 30 seg e substituindo o sobrenadante com NGM fresco + tampão LB. - Após a lavagem, encher o tubo com NGM + tampão LB a 50 ml e despeje em um frasco personalizado verme dispensa. Adicionar uma barra de agitação e mexa para manter os worms suspenso. º Condenúmero de vermes e em três mL 5 gotas como indicado acima. Diluir com NGM LB + até chegar 12-15 worms por 5 mL queda (~ 2,5-3,0 worms / mL).
NOTA: Um mínimo de cerca de 20 ml (60.000 worms) é necessário para preencher o espaço morto do recipiente de dispensação e cassete dispenser. Cada placa 384 poços requer cerca de 35 mil worms ou 11,5 ml de vermes suspenso. - Carga de 10 mL de cassetes de dispensação e esterilizar em priming com etanol 70%. Enxaguar o etanol por priming com água estéril.
- Insira a extremidade do cassete de distribuição para o balão de modo que seja logo acima da barra mexa sem interromper seu movimento. Certifique-se que os vermes continuam suspensas em todo o frasco inteiro. Programa o dispensador para dispensar a baixa velocidade com 2 pré-pulsos. Primeiro e executar pelo menos 10 ml de vermes suspenso. Preencha placas conforme necessário rapidamente para evitar que os vermes de se estabelecer na tubulação.
- Selar as placas com fita respirável.
- Coloque as placas em uma plataforma de agitação em uma incubadora à temperatura adequada para o seu ensaio. Não empilhar os pratos.
4. Análise de fluorescência
- Coloque a placa de alvo em um leitor de microplacas para medir a intensidade de fluorescência de cada bem com o comprimento de onda de emissão e excitação apropriada (Filtros para o nosso ensaio: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em).
- Calcular a proporção de GFP / RFP e normalizar com as leituras dos poços de controlo (sem composto ativar) para determinar a diferença exata dobra da intensidade de fluorescência derivados de tratamentos individuais.
5. Resultados representativos:
Nosso SKN-1 ensaio utiliza uma cepa repórter cromossomicamente integrado dual (VP596). Conforme mostrado na Figura 1, o número de vermes é bem correlacionada com o volume dispensado. Como mostrado nas Figuras 2A e 2B, GFP total e RFP fluorescência por poço é altamente reprodutível de bem para o bem através de uma placa de 384 poços. Conforme mostrado na Figura 2C, un induzida Pgst-4:: GFP fluorescência é linearmente correlacionada com PDOP-3:: RFP em 384 poços. Quando expresso como uma razão de GFP / RFP, fluorescência torna-se altamente reprodutível de bem para o bem através de uma placa de 384 poços (compare o coeficiente de variação da Figura 2D para 2A), demonstrando a capacidade do PDOP-3:: RFP repórter para reduzir a variabilidade. Conforme mostrado na Figura 3, a indução de boas práticas agrícolas em relação a RFP com uma SKN-1 ativando xenobióticos (38 mM juglone) é robusto e altamente reprodutível através de uma placa de 384 poços.
Figura 1. Número de worms versus volume dispensado. Worms foram diluídas a cerca de 2/μl e dispensado em uma placa de 24 poços para a contagem manual com um estereomicroscópio. N = 8 poços por volume.
Figura 2. Fluorescência total de worms dispensado em uma placa de 384 poços é reproduzível. Worms foram diluídas a cerca de 2.5/μl mL e 30 foi dispensado em cada poço de uma placa 384 poços. GFP (A) e RFP fluorescência (B) de todos os poços tiveram um coeficiente de variação abaixo de 9%. (C) de fluorescência da GFP é altamente correlacionada com a RFP fluorescência. (D) Cálculo da proporção de GFP para RFP reduziu o coeficiente de variação abaixo de 6% (A, B e D) As linhas contínuas indicam os meios e linhas quebradas indicam três desvios-padrão acima ou abaixo da média.
. Figura 3 Ativação do Pgst-4:: GFP é robusta e consistente. Aproximadamente 75 L4 worms foram dispensados em todos os poços de uma placa de 384 poços e 38 juglone mM foi adicionado em cada outra coluna. GFP e RFP fluorescência foi medida após 21 h de incubação. A média relativa de fluorescência de todos os índices de controle (1.0) e juglone poços (8.9) são marcadas com linhas sólidas. Três desvios padrão acima da média dos controles e abaixo da média juglone são marcados com linhas quebradas.
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Discussion
Nós apresentamos um método para cultivo e distribuição de um grande número de nematóides transgênicos. O equipamento utilizado para vermes é padrão para laboratórios de clonagem molecular e da manipulação de líquidos e equipamentos de fluorescência é padrão para os laboratórios de processamento de um grande número de microplacas. Outros métodos de dispensar um grande número de viver C. elegans exigem partículas caros equipamentos de triagem 19. O Pgst-4:: ensaio de GFP pode ser usada para triagem de moduladores pequena molécula de fatores colar 'n' cap transcrição e para detectar contaminantes xenobióticos e antioxidantes em amostras ambientais e alimentos 14,16. Robusta induzível repórteres transgênica GFP estão disponíveis para uma ampla gama de caminhos e estímulos ambientais 4, e, portanto, o nosso método deve ser aplicável a moduladores de desenvolvimento de muitos caminhos e para detectar um amplo espectro de contaminantes.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
C. elegans transgenes foram fornecidos pelo Centro de Genética Caenorhabditis (University of Minnesota, Minneapolis, MN). Este trabalho foi financiado pelo NIH R21 conceder NS0667678-01 a KS. Todos os autores participaram da coleta, análise e interpretação dos dados. CKL, KS, e KPC participaram da elaboração e revisão do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled(352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nalge Nunc international | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone)Juglone | Acros Organics | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
References
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