Summary
Процедура жидкой основе культивирования и отпуск
Protocol
1. Подготовка бактериальных пищевых червь
День 1
- Добавьте 5 мл насыщенного Е. OP50 кишечной бактериальной культуры до 500 мл бульона Потрясающе дополнена с 50 мкг / мл стрептомицина и расти в инкубатор встряхивания (225 оборотов в минуту) в течение ночи при температуре 37 ° C.
День 2
- Сплит ночь бактериальной культуры в десятку 50 мл пробирки центрифуги и бактерий в охлажденном центрифуге при 2500 RCF течение 20 минут.
- Декантировать от LB бульоне и ресуспендируют каждую бактериальную гранул в 10 мл жидкой питательной среды нематоды (НГО). Встряхните горизонтально полу шейкере в течение 15 минут для ресуспендирования бактерий. Для того, чтобы NGM буфера, добавляют 3 г NaCl на 1 л деионизированной воды и автоклав. Остудить до 55 ° С и добавить для того, следующие стерильные растворы: 1 мл 1 М CaCl 2, 1 мл 1 М MgSO 4 и 25 мл 1 М фосфат калия, рН 6,0.
- Центрифуга бактериальные культуры в охлажденном центрифуге при 2500 RCF течение 20 минут.
- Декантировать с буфером NGM и весят бактериальных гранул.
- Добавить равный объем NGM буфера для ресуспендирования гранулы, аликвоту 3 мл бактерий концентрата в 15 мл пробирки, и хранить при температуре -20 ° C.
2. Крупномасштабные C. Элеганс культуральной жидкости
Мы используем трансгенные линии VP596 (dvIs19 [pAF15 (GST-4:: GFP:: NLS)]; vsIs33 [доп-3:: RFP]) с двумя люминесцентными конструкций: Pgst -4:: GFP 14 для контроля СКН-1 деятельности и PDOP-3:: RFP 17 в качестве стандарта для червя нормализации числа.
День 1
- Смешайте 150 мл NGM буфера, 1,5 мл LB бульоне, 150 мкл 5 мг / мл холестерина (в этаноле) и 75 мкл 100 мг / мл стрептомицина. Фильтр-стерилизации смеси и добавить в 1 л стерильной колбе.
Примечание: добавление 1% LB бульоне в буфер NGM помогает предотвратить червей от прилипания к стеклянной посуды и Пластик, но этой суммы недостаточно, чтобы поддерживать рост бактерий. - Синхронизация с червями стандартная процедура гипохлорита 18. До 0,5 мл беременных черви могут быть обработаны в одной трубке 15 мл с 5 мл раствора гипохлорита (3,75 мл дистиллированной воды, 1 мл отбеливателя, и 250 мкл 10 N NaOH). Мойте яйца выпущен стерильной водой и ресуспендируйте их в 10 мл буфера NGM.
- Разбавьте образец яйца 100 раз в NGM буфер (например, 100 мкл в 10 мл) и подсчитать количество яиц в трех отдельных 5 мкл аликвоты. Несколько среднем число на 200 000 (100 коэффициент разбавления х 2000) для оценки общего количества яиц.
- Добавить 200 000 до 2 млн. штук яиц в колбу с буфером NGM и встряхните культуры на 100 оборотов в минуту при 20 ° C.
День 2
- По крайней мере 16 часов после добавления яйца в колбу, используйте стерильные серологические пипетки, чтобы удалить около 0,5 мл приостановлено червь культуры. Внесите три 5 мкл капель на стерильную крышку чашки Петри. Место крышкой в морозильной камере -20 ° С в течение 1-2 минут, чтобы парализовать червей. Граф среднее число живых червей вылупились в 5 мкл, а затем несколько по 30000 (150 мл / 5 мкл), чтобы оценить общее количество вылупившихся червей.
- Оттепель трубки замороженных OP50 бактериальной культуры (протокол 1.6) и добавить 3 мл 50% OP50 на червя культуры в 500000 вылупились червей. Встряхните колбу на 100 оборотов в минуту при 20 ° C. Черви будут развиваться в L4 личинок и молодых людей в около 51 часов. OD600 бактерий должно быть около 2,200 в начале. Монитор количество бактерий по поглощению и добавить больше, если OD 600 опускается ниже 0,900.
3. Сбор червей и дозирования
День 4
- Используйте стерильные серологические пипетки для передачи около 0,5 мл приостановлено червь культуры стандартные пластины агара NGM. Посмотреть черви с стереомикроскопа, чтобы убедиться, что большинство из них L4 личинок или молодых взрослых. L4 личинки будут иметь вентральной ясно пятно в середине тела. Молодые люди будут немного больше, и не будет иметь четкое пятно.
- Налейте червь культуры в стерильные 50 мл пробирок и места труб в стойке пробирку на настольный. Разрешить червей урегулировать в течение приблизительно 10 минут. Удалить супернатант аспирацией или пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть важно, чтобы удалить невылупившиеся яйца или червей, которые не развивались, потому что они решат медленнее, чем L4 личинок и молодых взрослых. - Соберите все черви в единый 50 мл трубки и промыть NGM буфере с 1% LB бульоне (НГО + LB) 3-4 раз, чтобы удалить бактерии.
Примечание: Это лучше всего делать в ведре размахивая-центрифуга, собирая червей при 500 RCF в течение 30 сек и замены супернатант со свежими NGM + LB буфера. - После мытья, заполнить трубу с NGM + LB буфера до 50 мл и вылить в пользовательских червь дозирования колбу. Добавьте небольшое мешалкой и движение, чтобы сохранить червей приостановлено. Граф-йэлектронной количество червей в трех 5 мкл капли, как указано выше. Разбавить LB NGM + пока вы не получите 12-15 червей на 5 мкл каплю (~ 2,5-3,0 черви / мкл).
ПРИМЕЧАНИЕ: минимум около 20 мл (60000 червей) необходимо, чтобы заполнить пустое пространство из отпуска колбу и диспенсер кассету. Каждый 384-луночного планшета требуется около 35 тысяч червей, или 11,5 мл приостановлено червей. - Нагрузка 10 мкл дозирования кассету и стерилизовать грунтовки с 70% этанола. Полоскание этанола грунтовки стерильной водой.
- Вставьте конец отпуска кассету в колбу так, чтобы она чуть выше мешалкой, не нарушая его движения. Убедитесь, что черви остаются взвешенными в течение всего колбу. Программа диспенсер обойтись на низкой скорости с 2 предварительно импульсов. Премьер и запустить не менее 10 мл взвешенных червей. Заполните пластин при необходимости быстро, чтобы предотвратить червей поселиться в трубку.
- Уплотнение пластин с дышащей ленты.
- Место пластин на встряхивая платформы в инкубаторе при соответствующей температуре для вашего анализа. Не ставьте пластин.
4. Люминесцентный анализ
- Место визирной в микропланшет-ридера для измерения интенсивности флуоресценции каждой скважины с соответствующей длиной волны излучения и возбуждения (фильтры для нашего анализа: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em).
- Рассчитать отношение GFP / ППП и нормализации с показаниями контроля скважин (без активации соединения) для определения точного кратную разницу в интенсивности флуоресценции производных от индивидуального лечения.
5. Представитель Результаты:
Наши SKN-1 использует анализ хромосомно встроенных контроллера напряжение репортера (VP596). Как показано на рисунке 1, количество червей хорошо коррелирует с объемом обойтись. Как показано на рисунках 2А и 2В, общая GFP и RFP флуоресценции на лунку очень воспроизводимые от скважины к скважине через 384 луночный планшет. Как показано на рис 2С, не-индуцированной Pgst-4:: GFP флуоресценции линейно коррелирует с PDOP-3:: ЗП по 384 скважин. При выраженной как отношение GFP / ППП, флуоресценция становится очень воспроизводимые от скважины к скважине через 384-луночного планшета (сравнить коэффициент вариации из рисунка 2D до 2) демонстрация способности PDOP-3:: RFP репортер уменьшить изменчивость. Как показано на рисунке 3, индукция относительной GFP для ППП с СКН-1 активации ксенобиотиков (38 мкМ юглон), является перспективным и очень воспроизводимые через 384 луночный планшет.
Рисунок 1. Количество червей в сравнении с объемом обойтись. Черви разбавляли до примерно 2/μl и разливали в 24-луночный планшет для ручного подсчета с стереомикроскопа. N = 8 скважин в объеме.
Рисунок 2. Всего флуоресценции червей обойтись в 384-луночного планшета является воспроизводимым. Черви разбавляли до примерно 2.5/μl и 30 мкл был разлит в каждую лунку 384 луночный планшет. GFP () и ППП (В) флуоресценции всех скважин, коэффициент вариации ниже 9%. (C) GFP флуоресценции тесно связана с ППП флуоресценции. (D) Расчет соотношения GFP для ППП снижается коэффициент вариации ниже 6% (A, B и D) Сплошные линии указывают средства и ломаные линии указывают на три стандартных отклонения выше или ниже среднего.
. Рисунок 3 Активация Pgst-4:: GFP является надежным и последовательным. Примерно 75 L4 черви были распределены во все лунки по 384-луночного планшета и 38 мкМ юглон был добавлен в любой другой колонке. GFP и RFP флуоресценции измеряли после 21 ч инкубации. Средняя относительная флуоресценция отношения всех контрольных (1,0) и юглон скважин (8,9) обозначены сплошными линиями. Три стандартных отклонения выше среднего и контроль ниже юглон означает обозначены пунктирными линиями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представляем метод выращивания и приготовления большого количества трансгенных нематод. Оборудования, используемых для культивирования червей является стандартным для лабораторий, осуществляющих молекулярное клонирование и наливных и флуоресценции оборудования является стандартной для лабораторий обработку большого количества микропланшетов. Другие методы выдачи большого количества живых C. Элеганс требуют дорогостоящего частиц сортировочного оборудования 19. Pgst-4:: GFP анализа могут быть использованы для выявления небольших модуляторы молекуле фактора воротник-н-шапка транскрипции и для обнаружения ксенобиотиков и окислитель загрязняющих веществ в окружающую среду и проб пищевых продуктов 14,16. Прочная индуцибельной трансгенных GFP журналистам доступны для широкого круга пути и стимулы окружающей среды 4, поэтому наш метод должен быть применим к разработке модуляторов многих путей и обнаруживать широкий спектр загрязняющих веществ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
C. Элеганс трансгены были предоставлены Caenorhabditis генетический центр (Университет Миннесоты, Миннеаполис, Миннесота). Эта работа была поддержана NIH грант R21 NS0667678-01 для KS. Все авторы участвовали в сборе, анализе и интерпретации данных. CKL, KS, и КЗК участие в написании и пересмотра рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled(352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nalge Nunc international | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone)Juglone | Acros Organics | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
References
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery. Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).
- WormBase [Internet]. , Available from: http://www.wormbase.org (2012).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).
- Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).
- Hasegawa, K. Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).
- Tullet, J. M. A. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell. 132, 1025-1038 (2008).
- Oliveira, R. P. Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf. Aging Cell. , Forthcoming (2009).
- Park, S. -K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8, 258-269 (2009).
- Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. Antioxid Redox Signal. , (2010).
- Kwak, M. K., Kensler, T. W. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention. Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).
- Leiser, S. F., Miller, R. A. Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice. Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).
- Link, C. D., Johnson, C. J. Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).
- Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity. Toxicol Sci. , (2010).
- Hasegawa, K. A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food. Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).
- Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).
- Hope, I. A. C. elegans, a Practical Guide. , Oxford University Press. (2005).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).
